外源TGF-β1基因在小鼠ES细胞中的表达及其对细胞分化的影响

本文利用逆转录病毒载体Dol,在其BamHⅠ酶切位点插入猪TGF-β1的1.7kbcDNA,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将该质粒DNA转染到小鼠ES-5细胞,经G_(418)筛选获得抗G_(418)的ES-5细胞克隆(ES-T),经RNA点杂交,Northern印迹杂交证明有6个细胞克隆能表达外源猪TGF-β1的mRNA,其中两个杂交信号较强的克隆进一步用Southern印迹杂交,也证明猪TGF-β1基因已整合到ES-5细胞基因组。经SELISA和生物活性测定,证明ES-T细胞存在着过度表达的TGF-β1基因产物。ES-T细胞生长特性与其亲代ES-5细胞相比,未发现明显差异。经低浓度RA处理悬滴培养的ES-T6细胞,将形成的拟胚体移至用白明胶铺底的培养板中,则最终有95%左右的拟胚体分化出血管样结构,而ES-5细胞在相同培养和处理条件下,只有17.8%形成无规则的管状结构,这结果提示ES-T6细胞基因组中外源TGF-β_1的额外表达,在调节该细胞株分化形成血管样结构中起着重要作用。同时,我们的实验体系也提供了一个适合于研究内皮细胞发生和血管形成的模型。     

肺泡型细胞内表皮生长因子和转化生长因子α、β_1及其受体基因表达的研究

分离培养成年大鼠的肺泡 型细胞 ,通过斑点杂交、原位杂交和免疫组织化学染色 ,研究肺泡 型细胞内表皮生长因子 (EGF)、转化生长因子 α和 β1 (TGFα、TGFβ1 )及其受体基因的表达。结果显示肺泡 型细胞可表达 EGF、TGFα和TGFβ1 ,也可表达相应的 EGF受体 (EGFR)、TGFβ受体 型和 型 (TβR 、TβR )。表明肺泡 型细胞是合成和分泌 EGF、TGFα和 TGFβ1 的细胞之一 ;细胞凭借其 EGFR、TβR的存在 ,其增殖与分化可能受 EGF、TGFα和 TGFβ1 的旁分泌和自分泌两种途径调控。     

ES细胞分化为血管样结构的机理探讨—TGF-β1在血管形成中的作用

本文利用小鼠ES细胞的拟胚体培养和三维胶原蛋白培养系统研究了外源rhTGF-β1对ES细胞分化为血管样结构的影响。结果发现,无论是培液中添加外源rhTGF-β1或细胞经基因转染而有过度表达的TGF-β1都对ES细胞形成血管样结构起着决定性的作用。培液中添加适量的TGF-β1抗体,则过度表达TGF-β1的ES-T6细胞分化为血管样结构的频率明显地受到抑制,相似于其亲本ES-5细胞的分化水平。在Ⅰ型胶原三维培养系统中的单层ES-5细胞培液中添加rhTGF-β1时,明显地促进ES-5细胞形成血管样结构。用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白抗体分别作免疫荧光染色也观察到ES-T6细胞分化产生的上皮样细胞和圆形细胞都显示较强的荧光反应,这些现象提示TGF-β1可能通过调节细胞外基质成份而行使其在血管形成中的作用。同时,我们在ES-5细胞和ES-T6细胞的分化衍生物中都检测到bFGF的mRNA。因此,TGF-β1在血管样结构形成中的作用,除了它对于细胞外基质成份有关基因的直接调控外,还可能通过调节细胞的bFGF等一类与血管内皮细胞生长和分化相关的生长因子而间接地行使其生物学功能。在本实验系统中,ES-T6细胞分化为内皮细胞及血管样结构必需有低剂量RA的诱导,其作用机理有待研究。     

肺泡Ⅱ型细胞表皮生长因子和转化生长因子α、β1及其受体表达的研究

分离培养成年大鼠的肺泡Ⅱ型细胞,通过斑点杂交、原位杂交和免疫组织化学染色,研究肺泡Ⅱ型细胞内表皮生长因子（EGF）、转化生长因子α和β1（TGFα、TGFβ1）及其受体基因的表达。结果显示肺泡Ⅱ型细胞可表达EGF、TGFα和TGFβ1,也可表达相应的EGF受体（EGFR）、TGFβ受体Ⅰ型和Ⅱ型（TβRⅠ、TβRⅡ）。表明肺泡Ⅱ型细胞是合成和分泌EGF、TGFα和TGFβ1的细胞之一;细胞凭借其EGFR、TβR的存在,其增殖与分化可能受EGF、TGFα和TGFβ1的旁分泌和自分泌两种途径调控。     

内皮细胞生长状态对血管平滑肌细胞增生迁移的影响

实验通过建立细胞共培养体系,探讨内皮细胞生长状态对血管平滑肌细胞增生迁移的影响及机制。检测指标包括~3H-TdR掺入、细胞周期、细胞迁移计数和α-SM-actin mRNA表达。结果显示,融合生长内皮使平滑肌细胞~3H-TdR掺入量明显降低,增加平滑肌细胞停留在G_0/G_1期的比例,上调平滑肌细胞α-SM-actin mRNA表达;而对数生长内皮细胞使平滑肌细胞~3H-TdR掺入量明显升高,促进平滑肌细胞由 G_0/G_1期进入G_2/M和S期,下调平滑肌细胞α-SM-actin mRNA表达。对照组平滑肌细胞在基础状态下存在少量迁移,对数增殖内皮细胞组平滑肌迁移数比对照组增高约4倍(P<0.01),而融合生长内皮细胞组平滑肌迁移数仅为对照组的0.5倍(P<0.05)。结果提示内皮细胞生长状态不同,对平滑肌细胞生物学特性的影响也不同,增殖期内皮明显促进平滑肌细胞增生迁移、下调平滑肌细胞α-SM-actin mRNA表达。     

低分子量透明质酸寡糖片段介导内皮细胞增殖的信号通路

为研究低分子量透明质酸寡糖片段(hyaluronan oligosaccharides, o-HA)对血管内皮细胞生长与迁移的影响,及透明质酸（hyaluronan,HA）受体（CD44与RHAMM）在此过程中的作用,首先通过细胞计数、MTT实验、细胞周期分布及单层细胞损伤模型修复实验,观察o-HA对血管内皮细胞（猪髂总动脉内皮细胞,porcine vascular endothelial cell line,PIEC）增殖及创伤愈合的影响．结果显示,o-HA明显促进血管内皮细胞生长,并且能够促进内皮细胞向创伤区迁移.蛋白质免疫印迹分析证明,o-HA作用于PIECs后,细胞Src激酶、ERK-1/2的磷酸化程度增强,c-Myc蛋白、周期蛋白D1表达水平增高.Src 激酶特异性的化学抑制剂PP2可轻度抑制ERK-1/2磷酸化;进而通过抗-CD44与抗-RHAMM抗体分别预先封闭细胞表面相应的特异性受体位点后,再用o-HA刺激细胞,探讨HA受体在o-HA介导PIECs信号传导过程中的作用．结果显示,抗CD44抗体不能抑制o-HA介导的ERK-1/2磷酸化;而抗RHAMM抗体可轻度抑制o-HA介导的ERK-1/2磷酸化．结果提示,o-HA具有促进血管内皮细胞增殖及创伤愈合的作用,其机制可能是通过血管内皮细胞表面受体RHAMM实现的.该作用可能通过激活Src激酶及细胞内MAPK（ERK-1/2）信号通路,启动早期反应基因转录,诱使c-Myc蛋白高表达,从而促进血管内皮细胞生长．该作用也可能与上调细胞周期蛋白 D1的表达有关．     

大鼠肝癌发生过程中转化生长因子-β1的表达及意义

为了进一步探讨转化生长因子-β1在肝癌发生中的作用和意义。本采用免疫组织化学ABC法,对二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌发生过程中转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）表达情况进行了观察。结果显示;在正常大鼠肝脏,TGF-β1的表达只局限于血窦内皮细胞或枯否细胞,汇管区血管内皮细胞及胆管上皮细胞,肝细胞呈TGF-β1阴性表达,诱癌早期（4-8周）,大鼠肝小叶内除血窦内皮细胞或枯否细胞呈TGF-β1阳性表达外,可见少量散在分布的肝细胞呈TGF-β1阳性表达,阳性肝细胞胞质内可见棕褐色阳性反应颗粒,随着肝癌发展,TGF-β1阳性肝细胞逐渐增多,至诱癌晚期（18周）,癌结节内的大多数肝癌细胞呈TGF-β1阳性表达。本研究显示TGF-β1与肝癌的发生和发展密切相关。至诱癌晚期（18周）,癌结节内的大多数肝癌细胞呈TGF-β1阳性表达,本研究显示TGF-β1与肝癌的发生和发展密切相关。     

转化生长因子—β（TGF—β）的结构

1978年,Delarco和Todar首先发现病毒转化的细胞能分泌一种具有使正常大鼠肾成纤维细胞表型发生转化能力的因子,它在表皮生长因子(EGF)存在的情况下使贴壁生长的细胞特性发生改变,获得在软琼脂培养基上生长形成克隆的能力,并失去生长密度依赖的抑制作用。因此,这种细胞因子被命名为转化生长因子-β(TGF-β)。在过去的10年中,发现TGF-β实际上是一种具有多种生物学功能的细胞因     

VEGF受体KDR胞外区基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

VEGF(血管内皮细胞生长因子,Vascular Endothelial Growth Factor)是刺激内皮细胞增殖和新生血管形成的最重要因子,与多种实体瘤的生长和转移密切相关。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常有前景的课题。将VEGF受体KDR胞外区前三个Loop 969碱基对的cDNA片段克隆到杆状病毒表达载体pFastBacI,与杆状病毒表达载体Bacmid同源重组后,转染昆虫细胞SF9,获得重组杆状病毒并证明了目的基因的高效表达。经Western blot证实表达产物的特异性。经ELISA和体外生物学活性检测表明表达产物可阻断VEGF的生物学活性,抑制鸡胚CAM血管的生长。     

TGF-β1基因转染大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的TGF-β1基因转染大鼠的ADSCs(adipose stromal cells,ADSCs),诱导其向软骨细胞分化,为软骨组织工程学种子细胞提供新方法。方法分离、培养大鼠的ADSCs,免疫荧光法进行鉴定;TGF-β1基因转染ADSCs,对转染后细胞进行筛选;MTT法测定筛选后细胞的增殖活性;RT-PCR、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测。结果成功分离、培养大鼠的ADSCs;细胞表面标志物CD29和CD44表达阳性,CD106和CD34表达阴性;基因转染后细胞的增殖力变强;转染TGF-β1的ADSCs在目的基因TGF-β1、SOX9、Aggrecan、Collagen II mRNA的表达和软骨特异性基质-Collagen II的分泌增强,明显高于对照组和转染空载体组;结果TGF-β1基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征,可以用作软骨组织工程的种子细胞。     

脑微血管内皮细胞条件培养液对MIP-1β诱导大鼠小胶质细胞迁移影响的机制

目的:研究经通络方药作用后的脑微血管内皮细胞条件培养液对MIP-1β诱导的大鼠小胶质细胞迁移的影响,以及由MIP-1β在小胶质细胞上的受体-CCR5介导细胞信号转导通路的调控作用.方法:将通络方药作用后的大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液加入到由5nM MIP-1β刺激6h后的原代大鼠小胶质细胞中,利用Transwell细胞迁移系统来观察小胶质细胞迁移,用Western blot法检测小胶质细胞CCR5,p-p38,P-JNK表达情况.结果:脑微血管内皮细胞条件培养液能够显著减少小胶质细胞迁移到Transwell下层的细胞数量(P<0.01),降低小胶质细胞上MIP-1β的受体CCR5表达,同时抑制了其下游信号蛋白p38和JNK的磷酸化.结论:通络方药作用后的脑微血管内皮细胞务件培养液可抑制由MIP-1β诱导的大鼠小胶质细胞迁移,其作用发挥可能是通过抑制MIP-1β的受体CCR5表达,降低了其下游通路上p38和JNK蛋白磷酸化程度实现.     

TGF-β在小鼠胎盘中的表达

利用原位杂交和免疫组化的方法对小鼠胎盘中的TGF-β（transform growth factor-β)mRNA和蛋白质进行检测,结果显示：在妊娠第7.5-9.5天,TGF-β主要在子宫蜕膜中表达,而且表达逐渐增强。说明这一时期TGF-β的作用主要是控制滋养层细胞的侵入,这种控制是通过对PA（plasminogenin activotor)和MMP（matrix metalloproteinase)两类主要的细胞外蛋白水解酶的抑制作用来实现的,到妊娠10.5天时,滋养层巨细胞明显表达TGF-βmRNA和蛋白质,这与其功能的转换是一致的,因为此时的滋养层巨细胞体积变大。停止增殖,其功能也从侵入型向内分泌型转换。海绵滋养层细胞从第9.5天开始表达TGF-βmRNA,而TGF-β抗原从第10.5天开始出现,第11.5-12.5天,TGF-βmRNA的表达达到最高,此时的TGF-β的作用是调控胎儿血管的形成,另外,TGF-β对免疫系统有强烈的抑制作用,妊娠中后期海绵滋养层细胞可能通过大量表达TGF-β以调节局部免疫,避免母体对胎儿的免疫排斥。     

卵巢癌中TGF-β/Smads信号通路的功能研究

为探讨卵巢癌细胞中TGF-β的信号传导情况及TGF-β／Smads信号通路各组分在卵巢癌发生中的作用,采用MTT和活细胞计数方法研究了TGF-β1对卵巢癌细胞系HO-8910、HO-8910PM及SKOV3的生长抑制作用;并应用RT-PCR、荧光免疫组化等方法研究了TGF-β／Smads传导通路中各组分的表达和定位以及TGF-β1刺激前后Smad7和P-Smad2定位及表达的变化。结果显示,TGF-β1对细胞系SKOV3没有生长抑制作用．而SK-OV3细胞表达了TGF-β／Smads信号通路中的所有已知成分。且3种卵巢癌细胞在TGF-β1刺激后Smad7mRNA瞬时表达增加,Smad7蛋白表达亦增加并由胞核转位到胞浆,P-Smad2由胞浆转位到胞核。结果表明TGF-β／Smads信号传导通路在卵巢癌细胞HO-8910、HO-8910PM和SKOV3中是完整的,SKOV3细胞逃逸TGF-β介导的生长抑制作用可能是由于TGF-β／Smads信号通路下游发生异常。     

肿瘤新生血管相关内皮细胞受体研究进展

血管生成对肿瘤的生长,存留和转移是至关重要的,增殖的肿瘤血管内皮细胞不同于静止期内皮细胞,增生血管内皮细胞上特异或高表达的许多受体目前已被鉴定,它们是肿瘤抗血管生成疗法的理想靶点,简要综述了其中主要的几种受体,如血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体家族,Tie受体族,整合素受体αvβ3,ATP合成酶等。     

db-cAMP对转化细胞钙调素基因表达与细胞骨架的影响

转化的C_3H_(10)T_(1/2)细胞表现增殖速度加快、表面微绒毛增加,细胞变圆,叠层生长,ConA受体呈帽状分布,微管、微丝、纤粘蛋白分布明显减少。与增殖有关的癌基因c-fos表达增强,同时发现与细胞增殖、转化和细胞骨架调节有关的钙调素(CaM)基因表达加强。用1mmo/Ldb-cAMP处理转化细胞,观察到CaM基因和原癌基因c-fos的表达分别在处理后1小时和2小时急剧下降。处理后4—5天,转化细胞表型趋正常化,大部分细胞恢复单层生长。细胞表面微绒毛和泡状物减少,ConA受体帽状分布消失,恢复分散分布在细胞膜上的特点。细胞生长明显被抑制,用优先在G_1期表达的4F_1 cDNA为探针进行分子杂交,证实了经db-cAMP处理后的细胞被阻抑在G_1期。经db-cAMP处理6天的转化细胞中微管、微丝、纤粘蛋白基本恢复正常分布。实验表明CaM的表达增强与转化细胞表型变化和细胞骨架组装减弱密切相关,db-cAMP作用后CaM表达下降是抑制转化细胞增殖并使细胞表型和细胞骨架分布趋于正常的关键事件之一。     

TGF-β1基因真核表达载体的构建及在BMSCs中的表达

目的研究真核表达载体pCDNA3.1( )-TGF-β1在骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法基因克隆构建pCDNA3.1( )-TGF-β1真核表达载体,转染大鼠BMSCs,G418筛选获得稳定转染的细胞,RT-PCR、ELISA和免疫细胞化学检测其表达,MTT法检测其增殖活性.结果成功构建含TGF-β1基因的真核表达载体;RT-PCR、ELISA、免疫细胞化学证实了TGF-β1基因在BMSCs中至少可以表达一个月;MTT法提示转染TGF-β1基因可以促进BMSCs增殖.结论 pCDNA3.1( )-TGF-β1转染BMSCs可获得稳定表达.     

普伐他汀对心脏成纤维细胞转化生长因子-β1合成的影响

目的:探讨普伐他汀对醛固酮诱导新生大鼠心脏成纤维细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)的影响。方法:采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取和培养心脏成纤维细胞,应用ELISA、Western-blot、RT-PCR的方法分别测定醛固酮、普伐他汀以及甲羟戊酸对心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平和心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA和蛋白质的表达。结果:与正常对照组相比,醛固酮(10-7mol/L)可促进心脏成纤维细胞培养液中TGF-β1水平和心脏成纤维细胞TGFβ-1mRNA和蛋白质的表达,提前给予普伐他汀(10-5,10-4,10-3mol/L)能剂量依赖性地抑制醛固酮的上述作用,同时这种抑制作用可被甲羟戊酸所逆转。结论:普伐他汀可抑制醛固酮诱导的心脏成纤维细胞TGF-β1mRNA表达以及蛋白质的合成和分泌,其机制可能与甲羟戊酸代谢途径有关。     

转化生长因子-β1通过促进结缔组织生长因子表达抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖

目的:研究转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)对人胰腺癌细胞系PANC-1增殖的影响。方法:首先利用MTT检测重组TGF-β1、CTGF及anti-CTGF抗体处理PANC-1细胞后,细胞的增殖状态,用流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)检测转染pcDNA3.1(-)-CTGF后PANC-1细胞的凋亡情况,最后利用RT-PCR检测TGF-β1作用PANC-1细胞后CTGF mRNA的表达。结果:TGF-β1和CTGF均呈浓度依赖性抑制PANC-1细胞增殖,加入anti-CTGF抗体可以取消TGF-β1对PANC-1细胞增殖的抑制作用;FCM结果显示pcDNA3.1(-)-CTGF质粒转染促进PANC-1细胞凋亡;RT-PCR则证明TGF-β1促进PANC-1细胞中CTGF mRNA表达。结论:TGF-β1可能通过促进CTGF表达来发挥抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖的作用。     

AngⅡ对血管平滑肌细胞PDGF受体表达的影响

目的:研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管平滑肌细胞血小板源生长因子(PDGF)受体表达的影响.方法:采用大鼠主动脉球囊内皮剥脱术制备主动脉再狭窄模型,观察形态学变化;放免法测定主动脉AngⅡ含量;免疫印迹法测定主动脉PDGF-β受体含量,并与假手术组相比较.培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),AngⅡ刺激正常培养的与洛沙坦预处理过的VSMC 6 h,测定PDGF-β受体含量.结果:球囊内皮剥脱术后14 d,主动脉中层VSMC大量增殖,内膜显著增厚,AngⅡ含量显著升高(P＜0.05),PDGF-β受体表达显著增强(P＜0.05).AngⅡ诱导VSMC PDGF-β受体表达显著增强(P＜0.01),AngⅡ受体拮抗剂洛沙坦完全抑制AngⅡ对PDGF-β受体上调的诱导作用.结论:AngⅡ可通过其Ⅰ型受体诱导血管平滑肌细胞PDGF受体上调,这可能是AngⅡ促VSMC发生增殖的一个重要机制.     

硫化氢抑制TGF-β1诱导的人心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化

心脏成纤维细胞(CFs)具有广泛的功能,在维持正常的心脏结构及心脏重构过程均具有重要作用.转化生长因子-β1(TGF-β1)被认为是最强的刺激CFs转化为肌成纤维细胞(Myo FBs)的细胞因子并分泌Ⅰ,Ⅱ型胶原纤维.本研究主要探讨外源性硫化氢(H2S)-硫氢化钠(Na HS)是否影响CFs的增殖、迁移,及CFs向Myo FBs的表型转化,并探讨其作用机制.结果表明,H2S显著抑制TGF-β1诱导的HCF-av细胞增殖、迁移、向Myo FBs的表型转化,调节细胞生长,减少胶原合成,并抑制TGF-β1及活化Smad3蛋白表达水平.推测其机制可能为H2S抑制TGF-β1/Smad3信号通路.研究结果为临床治疗心脏纤维化及心室重构提供理论依据.