小鼠窦前卵泡培养成熟后卵母细胞纺锤体的变化

目的小鼠窦前卵泡体外培养得到成熟卵母细胞,观察卵母细胞的染色体和纺锤体形态,分析其变化及原因。方法完整小鼠窦前卵泡培养12 d,得到的卵母细胞进行免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察纺锤体和染色体的形态和分布。结果经过体外培养,得到GV、M I、MⅡ期卵母细胞分别占总数27.9%、37.2%、34.9%;GV期卵母细胞存在完整的染色质圆环,11.8%的M I期卵母细胞显示正常纺锤体和染色体;38.5%的MⅡ期卵母细胞显示正常的纺锤体和染色体。结论小鼠窦前卵泡经体外培养后能够得到成熟的MⅡ期卵母细胞,但是其效率较低。原因可能是卵母细胞骨架结构的异常使染色体分离障碍,部分卵母细胞停留于M I期;同时成熟卵母细胞的受精率低也与纺锤体异常有关。     

左归丸促进小鼠未成熟卵母细胞体外核成熟的实验研究

目的：研究左归丸对小鼠未成熟卵母细胞体外核成熟的影响。方法：制备左归丸含药血清,将生发泡（germinal vesicle,GV）期卵母细胞分别在不同采血时间获取的左归丸含药血清培养液中进行体外培养,观察左归丸含药血清对生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）和第一极体（the first polar body,PB1）排出的时效关系。结果：药物血清组卵母细胞GVBD的发生率高于正常血清组和对照组,于培养后4h差异最显著（P〈0.01）;药物血清组卵母细胞PB1的发生率高于正常血清组和对照组,于培养后18h差异最显著（P〈0.01）。结论：2～2.5h左归丸含药血清对未成熟卵母细胞体外核成熟具有明显促进作用。     

左归丸促进小鼠未成熟卵母细胞体外核成熟的实验研究

目的:研究左归丸对小鼠未成熟卵母细胞体外核成熟的影响。方法:制备左归丸含药血清,将生发泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞分别在不同采血时间获取的左归丸含药血清培养液中进行体外培养,观察左归丸含药血清对生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)和第一极体(the first polar body,PB1)排出的时效关系。结果:药物血清组卵母细胞GVBD的发生率高于正常血清组和对照组,于培养后4h差异最显著(P<0.01);药物血清组卵母细胞PB1的发生率高于正常血清组和对照组,于培养后18h差异最显著(P<0.01)。结论:2～2.5h左归丸含药血清对未成熟卵母细胞体外核成熟具有明显促进作用。     

绵羊卵母细胞体外核成熟抑制及其对胚胎发育潜力的影响

本研究旨在探讨次黄嘌呤 +dbcAMP或IBMX +dbcAMP对绵羊卵母细胞体外成熟的可逆性抑制作用 ,以及这种抑制作用对卵母细胞胚胎发育潜力的影响。自绵羊卵巢分离卵丘 -卵母细胞复合物进行体外培养 ,培养基中分别加入或不加入上述抑制剂。培养 6h后各组取部分卵母细胞固定染色检查卵母细胞核成熟情况 ;将其余的卵母细胞分别移入无抑制剂的成熟培养基中继续培养 18h后 ,再次检查各组卵母细胞核成熟情况 ,并进行体外受精和胚胎培养。结果表明 :次黄嘌呤 +dbcAMP或IBMX +dbcAM都分别能使 6 0 %以上的绵羊卵母细胞抑制在GV期。这种抑制是可逆性的 ,去除抑制剂后卵母细胞能恢复减数分裂 ,并加快由GVBD到MⅡ的成熟过程。各处理组受精率、卵裂率和囊胚发育率与对照组相比无显著性差异 ,表明卵母细胞的胚胎发育潜力没有受损。上述物质对卵母细胞成熟的可逆性抑制可用于研究卵母细胞成熟及其胚胎发育潜力的调节机制。     

用激光共聚焦显微术在小鼠卵母细胞中检测蛋白激酶C

用免疫荧光化学与激光共聚焦显微术结合的方法研究了小鼠卵母细胞中蛋白激酶C(PKC)α和βⅠ的表达和定位,以及蛋白激酶C(PKC)和皮质颗粒的双标记,探讨了以哺乳动物卵母细胞为实验对象进行免疫荧光共聚焦显微研究的简便方法.结果发现,PKC α和βⅠ在小鼠生发泡期和MⅡ期卵母细胞中都有表达,但表达部位存在差异.说明采用改进的激光共聚焦显微术,可以方便、灵敏地检测特异蛋白质在卵母细胞中的表达部位,从而为生殖、发育研究提供有效手段.     

绵羊卵母细胞体外核成熟和抑制及其对胚胎发育潜力的影响

本研究旨在探讨次黄嘌呤＋dbcAMP或IBMX＋dbcAMP对绵羊卵母细胞体外成熟的可逆性抑制作用,以及这种抑制作用对卵母细胞胚胎发育潜力的影响。自绵羊卵巢分离卵丘－卵母细胞复合物进行体外培养,培养基中分别加入或不加入上述抑制剂。培养6h后各组取部分卵母细胞固定染色检查卵母细胞核成熟情况;将其余的卵母细胞分别移入无抑制剂的成熟培养基中继续培养18h后,再次检查各组卵母细胞核成熟情况,并进行体外受精和胚胎培养。结果表明,次黄嘌呤＋dbcAMP或IBMS＋dbcAM都分别能使60％以上的绵羊卵母细胞抑制在GV期。这种抑制是可行性的,去除抑制剂后卵母细胞能恢复减数分裂,并加快由GVBD到MⅡ的成熟过程。各处理组肥精率,卵裂率和囊胚发育率与对照组相比无显著性差异,表明卵母细胞的胚胎发育潜力没有受损。上述物质对卵母细胞成熟的可逆性抑制可用于研究卵母细胞成熟及其胚胎发育潜力的调节机制。     

盐酸酸化可改善核抗原免疫荧光染色

免疫荧光染色(immunofluorescent staining, IF)技术广泛用于细胞或组织内抗原定性、定量或定位检测。然而,依常规染色步骤操作,在有些胞核抗原的检测中很难得到令人满意的结果。有研究者采用盐酸酸化预处理用于细胞增殖标记物5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)的荧光染色并获得良好效果。但此方法是否也适用于其他类型的胞核抗原,尚不清楚。为系统全面分析盐酸酸化在胞核抗原免疫荧光染色中的作用,本文以成年C57BL小鼠主要嗅觉表皮(MOE)为材料,分别对Ki-67、5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)三种不同类型的胞核抗原进行盐酸酸化处理免疫荧光染色。结果显示,当血清封闭和抗体浓度等条件一致时,室温下盐酸酸化2 h,Ki-67的染色效果最佳,而阴性对照与未酸化组均未出现阳性信号;同样经过盐酸处理2 h,5mC和5hmC染色也呈现较强的阳性信号。该研究表明,在一些胞核抗原免疫荧光染色中,使用盐酸酸化处理可显著提高染色效果。     

原癌基因c-myb在体外孕酮诱导小鼠卵母细胞成熟中的作用

目的：本文采用体外培养技术观察原癌基因c-myb对孕酮诱导的生发泡（GV）期小鼠裸卵体外成熟的影响。方法：建立小鼠裸卵体外培养模型,用不同浓度反义C-myb寡脱氧核苷酸（c-myb ASODNs）与GV期小鼠裸卵共孵育观察其对孕酮诱导的小鼠裸卵体外成熟的影响并探讨其机制。结果：在M199培养液中体外培养GV期小鼠裸卵24h,10μmol／L孕酮组与5μmol／L孕酮组比较有显著性差别（2 h GVBD％ P〈0.05,8 h PBI％ P〈0.05）．与20μmol／L孕酮组比较无显著性差别。10μmol／L c-myb AFODNs能抑制孕酮（10μmol／L）诱导的小鼠裸卵体外成熟（2 h GVBD％ P〈0.05,8 h PBI％ P〈0.01）。1×10^-4μmol／L dbcAMP、10μg／ml肝素钠可分别单独抑制孕酮诱导的GV期小鼠卵母细胞体外成熟（2 h GVBD％均P〈0.01,8 h PBI％均P〈0.01）．也可和反义c-myb ODN协同抑制孕酮诱导的卵母细胞体外成熟（2 h GVBD％均P〈0.01,8 h PBI％均P〈0.01）。结论：孕酮、原癌基因c-myb和cAMP、Ca^2＋参与了GV期小鼠卵母细胞的体外成熟,孕酮、cAMP和Ca^2＋调控卵母细胞成熟的机理可能与原癌基因c-myb表达有关。     

TGFα、EGF对绵羊卵母细胞成熟的影响

采用地衣红染色和免疫荧光的方法,观察了培养在基础培养液加BSA、血清、BSA EGF和BSA TGFα四组成熟培养液中绵羊卵母细胞的核成熟状态和α-微管蛋白分布,以及成熟培养后皮质颗粒(CG)的分布情况。结果表明培养22h的上述各组卵母细胞的核成熟率分别为63.5%、75.2%、73.1%、69.8%,处于第一次减数分裂末期的比率分别为27.0%、16.3%、15.9%、16.9%,EGF、TGFα和血清的添加明显提高了核的成熟率(P<0.05),显著减少了处于第一减数分裂末期的比例(P<0.05);α-微管蛋白的正常率(66.6%、66.6%、73.6%)也显著高于BSA组(43.3%)(P<0.05);CG发生迁移较好的卵母细胞比率分别为33.9%、58.8%、54.7%、47.9%,与BSA组相比,EGF和血清的添加明显促进了CG向皮质区的迁移(P<0.05)。实验表明TGFα和EGF均促进了绵羊卵母细胞成熟过程中从第一减数分裂末期向第二减数分裂中期的转变,并且能够替代血清中的某些成分促进和改善体外成熟卵母细胞核成熟的质量,EGF比TGFα更能促进绵羊卵母细胞胞质的成熟。     

THE MECHANISM OF SPERM HEAD TRANSFORMATION DURING MOUSE OOCYTE FERTILIZATION IN VITRO

用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２标记及氨银反应的方法在光镜和电镜水平上研究不同发育阶段的小鼠卵母细胞转化精核的能力。生发泡期卵母细胞质不能诱发精子组蛋白替代鱼精蛋白及精核解聚。生发泡破裂后,卵母细胞获得使精核解聚的能力,但直到卵母细胞完成成熟前,雄原核均不能形成。进一步研究表明,卵母细胞成熟过程中持续的蛋白质合成是雄原核形成所必需的,鱼精蛋白质磷酸化是精核解聚中的关键步骤。