人脑胶质瘤GDNF基因启动子I区H3组蛋白乙酰化修饰情况

目的：明确GDNF启动子I区在人脑胶质瘤中H,赖氨酸残基9位乙酰化（H3K9Ac）情况,探讨其对于GDNF在胶质瘤中表达的影响。方法：RT-PCR检测各组中GDNFmRNA的表达;建立基于Real．timePCR分析的染色质免疫共沉淀（CHIP）方法,检测12例胶质瘤与6例正常脑组织中GDNF基因启动子I区王H3组蛋白乙酰化情况。结果：Real-timePCR验证人脑胶质瘤GDNFmRNA的表达,转录水平随级另q的增高而增高,且低级别组、高级别组与正常组之间存在显著的统计学差异（P〈0．05）。启动子I区的H,组蛋白乙酰化水平,正常组与低级别组和高级别组之间比较均有显著性差异（P〈0．05）,且低级别与高级别之间也有显著性差异。结论：在人脑胶质瘤组织中,GDNF启动子I区发生了H3组蛋白高乙酰化修饰,这种修饰很可能会影响GDNF基因的表达。     

非小细胞性肺癌患者Runx3基因启动子区甲基化状态研究

目的:分析非小细胞性肺癌(NSCLC)中Runx3基因启动子区甲基化状态.方法:运用甲基化特异性PCR技术检测62例NSCLC组织和癌旁正常肺组织中Runx3基因启动子甲基化,并分析该基因启动子甲基化Runx3基因mRNA和蛋白表达的影响及其与临床特征之间的关系.结果:NSCLC组织中Runx3基因异常甲基化率(48.4%)显著高于癌旁正常肺组织中Runx3基因的异常甲基化率(17.7%,P＝0.000);发生完全或者不完全甲基化的NSCLC组织或者正常肺组织中Runx3基因mRNA和蛋白表达显著降低.Runx3基因启动子区高甲基化和肿瘤分化程度及临床分期有相关性(P＝0.041和0.009),而与NSCLC患者性别、年龄、有无吸烟史及肿瘤类型等临床特征无关(P=0.400,0.301,0.290和0.965).结论:Runx3基因启动子区异常甲基化是导致Runx3基因在NSCLC中表达下调的重要因素,有望成为NSCLC早期辅助诊断的分子标志物之一.     

脑胶质瘤组织中p16基因启动子区CpG岛甲基化检测及其临床意义研究

目的：研究脑胶质瘤中p16基因启动子区甲基化情况及其临床意义。方法：用甲基化特异性PCR技术检测42例脑胶质瘤组织和癌旁正常脑组织中p16基因启动子甲基化,并分析该基因启动子甲基化与临床病理特征之间的关系。结果：脑胶质瘤组织中p16基因异常甲基化率（38.27%）显著高于癌旁正常脑组织中p16基因的异常甲基化率（8.8%,P=0.000）。发生甲基化的肿瘤组织或者正常脑组织中p16基因mRNA和蛋白表达显著降低。此外,p16基因异常甲基化和肿瘤病理分级有相关性（P=0.007）,而与患者性别、年龄及肿瘤类型等临床特征无关（P=0.669,0.869和0.944）。结论：p16基因启动子区CpG岛高甲基化与p16表达下调相关,推测p16启动子区CpG岛高甲基化是导致p16基因在脑胶质瘤中表达下调的重要因素,有望成为脑胶质瘤早期辅助诊断的分子标志物之一。     

EGFR基因启动子区甲基化状态分析

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是HER/ERB-B跨膜受体激酶家族成员之一.EGFR的过表达促进细胞的增殖、存活和迁移,与许多实体瘤病人的低存活率相关.EGFR的表达受其启动子DNA甲基化调控.EGFR的转录沉默与CpG岛高甲基化相关.EGFR基因5′调控区包括1个富含GC的启动子,缺保守序列TATA盒和CAAT盒,有多个位点可以起始转录.本实验运用Bisulfite Sequencing PCR(BSP)方法检测了2种肿瘤细胞HeLa(EGFR+)和K562(EGFR)EGFR基因-1300～+600的甲基化状态.所检测目的片段共包含178个CpG位点.发现EGFR阳性与EGFR阴性两种细胞系的甲基化状态不同:宫颈癌细胞系HeLa转录起始点附近包括第一外显子区(-244～+91)处于非甲基化状态,白血病细胞系K562转录起始点附近包括第一外显子区呈嵌合性的高甲基化状态.因此,第一外显子比启动子区的甲基化状态更能反映基因的活化状况.     

脑胶质瘤MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态研究

目的：探讨脑胶质瘤患者O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因MGMT和错配修复基因hMLH1、hMSH2启动子CpG岛甲基化状态,及其在烷化剂化疗中的意义。方法：采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测39例脑胶质瘤和6例正常脑组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态,免疫组化方法测定蛋白表达。结果：脑胶质瘤患者组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46.2%、10.3%和20.5%,3种基因启动子未甲基化模式与其对应蛋白表达模式相似,并与患者性别、年龄、病理类型和病理分级无明显相关性。回顾性分析患者资料,显示39例脑胶质瘤患者中,MGMT基因甲基化的患者生存期显著高于MGMT基因未甲基化患者（P〈0.05,Log-rank检验）。结论：MGMT及错配修复基因甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件,可能与肿瘤的发生有关;检测MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态,在判断脑胶质瘤患者预后和预测烷化剂化疗耐药性中可能具有重要意义。     

脑胶质瘤患者组织和血清MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态检测

目的探讨脑胶质瘤患者组织和血清中MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子CpG岛甲基化发生率及相关性。方法甲基化特异性PCR（MSP）检测39例脑胶质瘤组织样本及32例预处理的脑胶质瘤血清样本中MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态。结果脑胶质瘤组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46．2％、10．3％和20．5％,肿瘤组织中至少有一种基因甲基化的发生率为64．1％（25／39）;在脑胶质瘤患者外周循环血液中检测到了相关基因甲基化系列,并且与组织中基因甲基化发生率明显相关。结论MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件,血清中相关基因DNA甲基化检测有可能为脑胶质瘤诊断和个体化化疗提供一种稳定的无创性检测指标。     

GDNF对多巴胺能神经元作用机制的研究进展

胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）是神经保护治疗帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）的一种神经营养因子,越来越多的在体和离体实验研究显示GDNF是中脑多巴胺（dopaminergic neuron,DA）能神经元的有效存活因子。GDNF受体是由结合在细胞质膜外的糖基化磷酯酰基（glycosyl-phosphatidylinositol,GPI）和GDNF功能性孤儿受体酪氨酸激酶Ret蛋白质组成。特异性的GDNF与其受体结合后,激活其胞内部分c-Ret,经由不同的第二信使来传递信号发挥作用。主要可能的机制有顺式作用和反式作用。而探索GDNF促进中脑黑质DA能神经元再生修复的可能机制,为进一步深入研究GDNF的作用机制提供科学依据。     

GDNF对原代培养脊髓神经元的影响

本文研究了GDNF对体外培养各个时期的脊髓神经元的作用。通过MTT法检测GDNF对脊髓神经元存活率的影响,发现GDNF能促进培养7天及14天的神经元存活。 通过活体观察、尼氏染色、NSE免疫细胞化学染色观察GDNF对脊髓神经元生长锥数目、胞体大小、突起长度及分枝、侧棘形成的影响,发现GDNF对体外培养1—3周的脊髓神经元有明显的营养作用。     

骨肉瘤中RASSF1A基因的甲基化状态研究

目的:分析骨肉瘤组织中RASSF1A基因甲基化状况。方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)分别检测44例骨肉瘤组织及相应的癌旁组织中RASSF1A基因启动子甲基化状态并分析其临床病理意义。结果:骨肉瘤组织中RASSF1A基因异常甲基化率(61.4%)显著高于癌旁正常骨组织中RASSF1A基因的异常甲基化率(20.5%),二者之间差异具有统计学意义(P<0.05)。RASSF1A基因异常甲基化导致组织中RASSF1A基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低。另外,RASSF1A基因异常甲基化和肿瘤组织分化程度及全身有无转移情况有相关性(P值分别为0.022和0.016),而与患者年龄、性别、肿瘤位置及大小等临床特征无关(P值分别为0.6944,0.977,0.786和0.831)。结论:RASSF1A基因启动子高甲基化可能是导致其在骨肉瘤中表达水平降低的分子机制之一,有望成为骨肉瘤早期辅助诊断的一个重要分子标志物。     

骨肉瘤中RASSF1A基因的甲基化状态研究

目的：分析骨肉瘤组织中RASSF1A基因甲基化状况。方法：运用甲基化特异性PCR（MSP）分别检测44例骨肉瘤组织及相应的癌旁组织中RASSF1A基因启动子甲基化状态并分析其临床病理意义。结果：骨肉瘤组织中RASSF1A基因异常甲基化率（61.4%）显著高于癌旁正常骨组织中RASSF1A基因的异常甲基化率（20.5%）,二者之间差异具有统计学意义（P〈0.05）。RASSF1A基因异常甲基化导致组织中RASSF1A基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低。另外,RASSF1A基因异常甲基化和肿瘤组织分化程度及全身有无转移情况有相关性（P值分别为0.022和0.016）,而与患者年龄、性别、肿瘤位置及大小等临床特征无关（P值分别为0.6944,0.977,0.786和0.831）。结论：RASSF1A基因启动子高甲基化可能是导致其在骨肉瘤中表达水平降低的分子机制之一,有望成为骨肉瘤早期辅助诊断的一个重要分子标志物。     

CDH1 基因启动子甲基化与宫颈癌临床病理类型的关系

目的:探讨分析CDH1基因启动子甲基化与宫颈癌临床病理类型的关系。方法:选取2012年5月~2015年7月我院105例宫颈癌患者为宫颈癌组,同时选取60例正常宫颈组织为正常组,以甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测CDH1基因启动子Cp G岛甲基化状态及高危型HPV DNA状态,分析CDH1基因甲基化状态与高危型HPV DNA状态及临床病理参数的关系。结果:宫颈癌组CDH1基因启动子甲基化阳性率为56.19%,明显高于正常组的6.67%,具有统计学差异(P0.05);宫颈癌组的高危型HPV DNA阳性率为84.76%,明显高于正常组的20.00%,具有统计学差异(P0.05);高危型HPV DNA与CDH1基因启动子甲基化的一致性分析结果具有统计学意义(P0.05);CDH1基因启动子甲基化率与患者的WHO组织分化程度分级、FIGO分期、组织病理学分型、肿瘤大小有关,差异有统计学意义(P0.05)。结论:宫颈癌CDH1基因启动子甲基化与WHO组织分化程度分级、FIGO分期、组织病理学分型、肿瘤大小具有关联,并与高危型HPV DNA阳性具有一致性,可以作为宫颈癌诊断和预后评估的参考指标。     

人肝癌细胞LASP1 启动子的克隆及其核心调控区域的初步鉴定

目的:克隆人肝癌细胞的LASP1基因的启动子区域并找出该基因启动子的核心调控区域。方法:提取肝癌Hep G2细胞总DNA,PCR扩增不同长度的LASP1启动子片段,克隆至PGL3-Basic载体中构建重组表达载体PGL3-P1(2059 bp)、PGL3-P2(1123bp)、PGL3-P3(909 bp)、PGL3-P4(574 bp)和PGL3-P5(159 bp),转化入大肠埃希菌(E.coli)DH5α中,提取质粒经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆并测序。将构建的重组表达载体、PGL3-Basic载体分别与内参质粒PRL-Tk共转染Hep G2细胞,48 h后经双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测其活性。结果:PCR结果、双酶切结果以及DNA测序结果表明成功构建了LASP1启动子荧光素酶报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测结果显示,与PGL3-Basic组相比,重组载体PGL3-P1、PGL3-P2、PGL3-P3、PGL3-P4均具有较强的启动子活性(P0.01),其中,PGL3-P4的活性最强。结论:成功构建了人肝癌细胞不同截断长度的LASP1基因启动子荧光素酶报告基因载体,确定了LASP-1基因启动子的核心区域(-581 bp~-8 bp),为进一步研究LASP1基因在肝癌细胞中表达的关键调节因素及分子机制奠定了基础。     

白血病患者骨髓中RASSFlA基因启动子甲基化状态及其临床意义

目的：通过检测各类型白血病骨髓中RASSFlA基因启动子区甲基化水平,探讨其对白血病分型的临床检测意义。方法：抽选93例不同类型白血病患者（观察组）予以甲基化特异性PCP（MSP）方法进行骨髓RASSFlA基因甲基化状态检测,研究不同类型白血病甲基化状态差异,同期抽选93例非白血病者为对照研究（对照组）。结果：观察组中有13例（13．98％）检测到RASSFlA基因甲基化,而对照组中RASSFlA基因甲基化率为0％,比较差异显著（P〈0．05）。不同类型白血病RASSFlA甲基化率比较：淋巴系显著高于髓系（P〈O．05）,急性与慢性白血病比较差异无显著性（P〉0．05）。结论：白血病骨髓中MSP法检测存在RASSFlA甲基化;而RASSFlA基因在淋巴系白血病中的甲基化概率明显增高,因此,对RASSFlA进行甲基化检测有可能作为白血病临床诊断分型的生物学指标之一。     

白血病患者骨髓中RASSF1A基因启动子甲基化状态及其临床意义

目的:通过检测各类型白血病骨髓中RASSF1A基因启动子区甲基化水平,探讨其对白血病分型的临床检测意义。方法:抽选93例不同类型白血病患者(观察组)予以甲基化特异性PCP(MSP)方法进行骨髓RASSF1A基因甲基化状态检测,研究不同类型白血病甲基化状态差异,同期抽选93例非白血病者为对照研究(对照组)。结果:观察组中有13例(13.98%)检测到RASSF1A基因甲基化,而对照组中RASSF1A基因甲基化率为0%,比较差异显著(P0.05)。不同类型白血病RASSF1A甲基化率比较:淋巴系显著高于髓系(P0.05),急性与慢性白血病比较差异无显著性(P0.05)。结论:白血病骨髓中MSP法检测存在RASSF1A甲基化;而RASSF1A基因在淋巴系白血病中的甲基化概率明显增高,因此,对RASSF1A进行甲基化检测有可能作为白血病临床诊断分型的生物学指标之一。     

盐酸普鲁卡因对人结肠癌HT-29细胞Syk基因甲基化及表达的影响

旨在探讨盐酸普鲁卡因(procaine,PCA)对人结肠癌HT-29细胞Syk基因甲基化及表达的影响。应用巢式双重甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-specific PCR,MSP)检测盐酸普鲁卡因处理前后HT-29细胞中Syk基因启动子的甲基化水平。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹技术观察HT-29细胞内Syk基因表达情况。MSP检测发现人结肠癌HT-29细胞中Syk基因存在甲基化,经盐酸普鲁卡因处理能够使Syk基因甲基化水平下降。RT-PCR和蛋白印迹分析结果显示,人结肠癌HT-29细胞经盐酸普鲁卡因处理后Syk基因表达上调。人结肠癌HT-29细胞中Syk基因启动子甲基化导致基因表达沉默,盐酸普鲁卡因能逆转Syk基因启动子区域CpG岛甲基化,使Syk基因活化并表达上调,提示盐酸普鲁卡因具有治疗结肠癌的潜在应用价值。     

含GDNF基因的慢病毒载体的构建和其在人胚胎神经干细胞中的表达

利用含胶质源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor, GDNF)基因的慢病毒(Lentivirus)载体转染了人胚胎来源的神经干细胞, 探讨了转染后GDNF在神经干细胞中的体外表达水平及其影响因素。首先GDNF基因被克隆入慢病毒载体, 通过瞬时转染法包装出病毒上清, 经滴度鉴定后分别按拷贝数分别为 1、2.5、5、10转染神经干细胞。转染后细胞经过潮霉素筛选得到均一表达GDNF的神经干细胞体系。其后分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR方法测定不同转染组细胞在不同时间点GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验中构建了表达GDNF基因的慢病毒载体, 包装出的病毒上清在体外培养条件下成功转染了神经干细胞, 经潮霉素筛选可以得到均一的持续表达分泌GDNF的人胚胎皮层神经干细胞体系。实验结果表明转染拷贝数可以影响GDNF的分泌水平, 相同条件下转染拷贝数越高, GDNF分泌量越多, 其基因表达水平越高。因此, 含GDNF的慢病毒载体可以成功转染人胚胎来源的神经干细胞, 使其持续表达GDNF, 转染过程中可以通过拷贝数在一定水平上控制GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。