TALENs介导的CCR5△32/△32突变赋予CD4+ U87细胞抵抗HIV-1感染的能力

CCR5Δ32/Δ32(C C chemokine receptor type 5,CCR5)基因型的骨髓干细胞移植,可以治愈感染人免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的患者。本研究运用TALENs结合同源重组技术产生纯合子的CCR5△32/△32突变,并赋予CD4+ U87 细胞抵抗HIV-1感染的能力。首先,采用重叠延伸PCR合成 CCR5△32 donor DNA。构建CCR5-TALENs 和CCR5△1-TALENs质粒,将CCR5-TALENs 及CCR5△1-TALENs质粒分别结合CCR5△32 donor DNA,共转染野生型CD4+ U87 细胞。其次,用T7E1酶切分析转染后的TALENs和CCR5△1-TALENs打靶效率。通过单克隆培养筛选CCR5△32/△32突变的单克隆细胞。最后,将CCR5△32/△32 CD4+ U87 细胞和野生型CD4+ U87细胞进行Bal HIV-1病毒攻击实验,采用ELISA方法检测上清中P24抗原含量。测序结果表明,通过重叠延伸PCR成功获得1 602 bp CCR5△32 donor DNA;CCR5-TALENs 质粒第1轮、第2轮和第3轮转染,打靶效率分别为14.80%, 38.20%和50.40%;从29个单个细胞培养的克隆中成功筛选出1个CCR5△32/△1基因型CD4+ U87细胞,CCR5与CCR5△32 donor DNA之间同源重组效率为1.7%; CCR5△1-TALEN质粒第2轮转染,打靶效率为23.5%,从34个单细胞培养的克隆中筛选出3个CCR5△32/△32 基因型CD4+ U87细胞,CCR5与CCR5△32 donor DNA之间同源重组效率达到8.8%。Bal HIV-1攻击实验表明,野生型CD4+ U87细胞培养上清第2、4、6、8、10、12 d,平均P24抗原含量分别为58.47±2.35、162.23±4.78、458.78±27.34、613.35±26.78、580.35±24.73、483.34±30.85 pg/mL。而CCR5△32/△32基因型CD4+ U87细胞的培养上清平均P24抗原含量分别为11.30±1.76、5.13±0.88、3.43±0.44、3.84±0.69、3.21±0.44、4.24±0.46 pg/mL。本研究表明,TALENs 结合同源重组技术无缝隙地介导了CCR5△32/△32突变,并赋予了CD4+ U87细胞抵抗HIV-1感染的能力。     

腺甘酸环化酶Cyr1突变对酿酒酵母时序寿命的影响

为了研究腺甘酸环化酶Cyr1对酵母细胞时序寿命的影响,我们使用Cyr1△与野生菌DBY746来检测酵母细胞的时序寿命,H_2O_2或热抵抗能力以及线粒体膜形态。结果表明,Cyr1△的时序寿命是DBY746的2.25倍,在强卡路里限制调节下,两者的生存时间均有延长,DBY746和Cyr1△达到10%生存率的时间分别为13d和45d。Cyr1△有更强的抵抗H_2O_2和热处理能力,同时发现Cyr1△比DBY746在培养第3d和第5d有更完整的线粒体膜形态。     

肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体对肌球蛋白ATP酶活性的影响

目的:探讨肌球蛋白轻链激酶(MLCK)钙调蛋白(CaM)结合位点突变体对肌球蛋白ATP酶活性的影响.方法:构建牛胃重组全长野生型MLCK CaM结合位点突变型蛋白(△CaM/MLCK);孔雀绿方法检测△CaM/MLCK对肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影响.结果:在无Ca2+/CaM存在时,随着△△CaM/MLCK浓度的增加,非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性明显增加;而磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性明显降低.结论:△CaM/MLCK对肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响表明MLCK具有非激酶活性.     

种群模型参数辨识的一种方法

1、M(。,m)模型的建立定理.对于微分方程 dnx,(t)dtn+口zd卜lx,(t) dtn一1+…+a。_:dx:(t) dt否,x,(‘)+box:(‘)+b3x;(‘)x:(‘)+…+”。·,x:(‘)‘二(‘)给定样本数据{x;(k)1,k二1,2,…,N,i=I,2,…,m,则该方程的参数向量a=〔a:aZ…a。一,ib:bZ…b二+:〕丁可通过〔(AIB)T(A{B)〕一’(A{B)TC辨识,其中,C=〔△,x;(2),△nx:(了),…,△。x,(N)〕T陈华豪等万卷s2/△,一‘x工(2)△“一‘x:(3)…△x:(2)△x:(3)A二一……△一’x,(N),△x,(、){,111\x,(z),x贯(1),x,(1)x:(1),…,x;(了).x二(I)B二‘1‘“’,‘飞‘”,‘1.:员.,‘2‘2’,”…     

失血性休克大鼠离体淋巴管对P物质的反应性

目的:应用离体淋巴管灌流技术,观察失血性休克(HS)发展进程中淋巴管对P物质(SP)的反应性。方法:Wistar雄性大鼠随机分为对照组(仅麻醉与手术)和HS组(通过股静脉放血至平均动脉血压为40 mmHg,复制HS模型,分为休克0h、0.5 h、1 h、2h、3 h五个亚组)。各组在相应时间点分离胸导管,制备淋巴管,3 cmH2O跨壁压下行离体灌流,分别给予从低到高浓度的SP,测量淋巴管收缩末期口径、舒张末期口径、收缩频率(CF)和被动管径,计算收缩幅度(CA)、泵流分数(FPF)和紧张指数(TI),以给予SP前后淋巴管的CF、TI、CA、FPF的差值△CF、△TI、△CA、△FPF作为评价淋巴管对SP反应性的指标。结果:Shock 0 h与shock 0.5 h大鼠淋巴管对多个或一个SP浓度的△CF、△TI、△CA、△FPF显著高于对照组,shock 2 h淋巴管对SP的△CF(3×10-7mol/L)、△TI(1×10-7mol/L)以及shock 3 h淋巴管对SP的△CF(1×10-7mol/L、3×10-7mol/L)、△TI(1×10-7mol/L)、△CA(1×10-7mol/L)均显著低于对照组。结论:休克淋巴管对SP反应性呈双相变化,即早期升高,晚期降低。     

苹果树冠层空气温差变化及其与环境因子的关系

于2002—2005年,采用红外测温仪观测得到苹果树主要生长季节冠层温度数据,结合同步观测得到冠层净辐射(Rn)、风速(V)、空气温度(Ta)和湿度(RH)等冠层微气象要素数据及0～80cm土壤含水量(SW),分析苹果树冠层-空气温差(△T)变化规律及其与环境因子的关系.结果表明:苹果树主要生长季节(萌芽期—果实迅速膨大期)晴天△T日变化呈多峰曲线分布,△T最高值都出现在12:00—13:00左右;阴天△T日变化呈多峰曲线分布,但△T绝对值明显低于晴天日.2003年和2004年晴天日14:00△T与Rn、V、RH及SW具有较好的复相关关系:ΔT=7.159-0.002Rn-0.061V-0.7RH-46.0SW(r=-0.825),与Rn、RH、V及SW的偏相关系数分别为0.125、-0.078、-0.036和-0.874,逐步回归方程式为ΔT=5.317-43.1SW,说明土壤水分对△T的影响程度相对最大.经2002年和2005年观测数据验证,△T观测值与计算值吻合关系较好,二者线性相关系数可达0.9083.这说明采用晴天日14:00时刻数据分析△T的影响机制,预测土壤水分含量具有很好的可行性.     

终极腐霉多不饱和脂肪酸代谢分析

目的:研究终极腐霉的脂肪酸成分及其代谢途径。方法:用气相色谱-质谱仪对终极腐霉的脂肪酸进行分析,阐述其代谢途径和菌体生理特性。结果:共有15种不饱和脂肪酸,占总脂肪酸的68.87%,其中EPA含量为8.15%。结论:终极腐霉具有高产EPA的商业应用前景,△6,△12,△15脂肪酸脱氢酶是阻碍EPA高产的关键所在。     

表达HPV16 E7的重组减毒李斯特菌诱导的小鼠抗肿瘤作用

[目的]研究运送HPV16 E7抗原的重组李斯特菌(LM4△hly::E7)诱导的特异性免疫应答,并进行免疫保护性效力评价.[方法]将重组减毒李斯特菌LM4△hly::E7腹腔注射免疫C57BL/6小鼠,2次免疫后,通过ELISPOT方法、细胞毒性杀伤实验及脾脏中效应性T细胞比例分析来研究重组菌激发的细胞免疫应答,同时,用ELISA方法检测小鼠血清中的E7抗体效价.最后,将TC-1肿瘤细胞皮下注射免疫小鼠进行保护性效力评价.[结果]ELISPOT结果表明,重组菌LM4△hly::E7以诱发Th1型免疫为主 ;同时LM4△hly::E7能够诱导强烈的特异性CTL杀伤活性,杀伤率可达到72％,与对照组相比,差异极显著(P＜0.01) ;并且研究结果显示重组李斯特菌诱导小鼠脾脏内产生较多数量的CD4+T细胞和CD8+T细胞(P＜0.05) ;ELISA检测LM4△hly::E7免疫小鼠血清中的E7抗体效价为1:400 ;保护性效力评价结果证实,LM4△hly::E7能够100％保护小鼠抵御肿瘤细胞的攻击.[结论]重组减毒菌LM4△hly::E7能够诱导机体产生E7特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答,具有较好的免疫保护效力,显示出减毒李斯特菌在肿瘤疫苗研发中的良好应用前景.     

速度增量及持续时间对瓦氏黄颡鱼幼鱼临界游泳速度的影响

为了考查速度增量(△v)和持续时间(△t)2个参数变化对鱼类临界游泳速度(critical swimming speed,Ucrit)的影响,于25℃条件下,首先以15%临界游泳速度作为△v,设置不同的持续时间(△t:5,10,15,30,60min);再以20min作为△t,设置不同的速度增量(△v:5%,10%,15%,20%,30%Ucrit),测定瓦氏黄颡鱼(Pelteobag vachelli)幼鱼的临界游泳速度。结果表明:随△t的增加Ucrit整体呈下降趋势,△t由5min增加至60min,绝对游泳速度(absolute swimming speed,Ua)由(47.4±0.7)cm.s-1下降至(39.1±1.5)cm.s-1(P<0.05),除15和30min无显著差异外,其余各组间均存在显著差异(P<0.05);而△v由5%提高至10%Ucrit,Ua由(44.1±0.6)cm.s-1显著增加至(47.0±0.4)cm.s-1(P<0.05),15%和20%Ucrit的Ua分别为(45.2±0.2)cm.s-1和(46.3±0.8)cm.s-1,与10%Ucrit组之间均无显著差异,但△v增...     

芽殖酵母PHO85基因对细胞周期调控的影响

本文通过同源重组方法,构建了一系列单倍体缺失株:pho85△单缺失株YPH600、pho85△cln1△双缺失株YPH610、cln1△cln2△双缺失株YPH640和半乳糖诱导存活的pho85△chn1△cln2△(GAL1-10PHO85)三缺失株YPH630。比较不同缺失株的生长速度可以看出,PHO85单基因缺失比CLN1、CLN2双基因缺失对细胞生长速度的影响大。在去诱导的不同时间,取细胞进行光学显微镜形态学分析及DNA含量的流式细胞计量分析(FACS)。结果表明YPH630三缺失株的单倍体酵母细胞休止在G1期。     

简讯二则

△全国铁路生物教学研究会第六次会员代表大会暨第六届学术年会于7月21～24日在湖北省宜昌市举行。(尚成礼)     

SYT09/PI荧光探针标记lasR rhlR基因缺陷对铜绿假单胞菌生物膜形成影响的体外实验研究

目的研究群体感应（QS）系统在铜绿假单胞菌生物膜（BF）形成中的作用。方法体外建立3 d QS系统完整的铜绿假单胞菌野生型PA01菌株与QS系统缺陷（lasRrhlR基因缺陷△lasR△rhlR）型菌株生物模型,通过SYT09/PI荧光探针标记,结合激光共聚焦显微镜摄取BF不同层面的图片,经图像结构分析（ISA）软件分析获得QS系统lasRrhlR缺陷株,PA01菌株BF相关空间结构参数。结果培养第3天PA01菌株可形成较厚、有孔状通道的成熟BF结构,而△lasR△rhlR菌株仅形成明显稀薄的早期BF结构,△lasR△rhlR菌株的3 d BF厚度为（7.36±0.2）μm,PA01菌株为（21.64±0.57）μm（P〈0.05）,区域孔率（areal porosity,AP）分别为：（0.902±0.006）、（0.928±0.002）;平均扩散距离（average diffusion distance,ADD）和结构熵（textural entropy,TE）在△lasR△rhlR菌株分别为：（1.503±0.029）和（5.706±0.190）;在PA01菌株分别为：（1.467±0.015）和（5.213±0.111）,△lasR△rhlR菌株AP较PA01菌株低（P〈0.05）;而ADD、TE较PA01菌株高（P〈0.05）。结论△lasR△rhlR基因缺陷明显影响铜绿假单胞菌的BF形成能力,QS系统lasRrhlR基因在铜绿假单胞菌BF形成中发挥重要作用。     

中国MAB1988年拟召开的部分会议

△生态学研究计划工作会议:1988年4月在北京召开生态学研究计划(CERP)指导委员会工作会议,检查计划执行情况,商讨并解决计划执行中的问题。△海岸带国际学术会议,1988年在南京召开“海岸带国际学术讨论会,”交流在海岸带研究、开发利用和保护方面的成果和经验。△城市生态研究讨论班:1988年10月,和中国生态学     

Q 值调整个体化准分子激光原位角膜磨镶术术后角膜

目的:观察Q值调整非球面切削与标准化LASIK术后不同角膜直径下的角膜的非球面变化来分析Q值引导个性化切削技术的临床效果。方法:前瞻性研究。随机选取2010年至2011年来我院就诊的准分子手术患者35例68眼,分别进行标准化LASIK(S组:17例34眼)和Q值调整个体化LASIK(Q组:18例34眼)矫治。术前2组各项指标均相似,差异无统计学意义。术前屈光度数分别为标准组球镜平均值为-4.76±2.02D(-1.5D～-9.75D),柱镜平均值为-0.71±0.7D(0～-2.5D)和Q值个体化组球镜平均值为-4.78±2.21D(-1.5～-9.5D),柱镜平均值为-0.84±0.55D(0～-2.5D)两组,对比两组非球面切削与标准化LASIK术后1个月不同角膜直径下的Q值及△Q。结果:两组术前Q10、Q15、Q20、Q25、Q30平均值分别为标准组:-0.12、-0.17、-0.20、-0.25、-0.30,Q值个体化组:-0.14、-0.19、-0.22、-0.27、-0.32.。术后一个月两组的△Q(△Q=Qpost-Qpre)△Q10、△Q15、△Q20、△Q25、△Q30分别为标准组:0.58、0.88、1.08、1.10、0.85,Q值个体化组,0.39、0.75、1.03、1.10、0.84。△Q10和△Q15术前术后变化在角膜直径为3.5mm之内时的差异有统计学意义。结论:Q值调整的个体化准分子激光原位角膜磨镶术术后角膜非球面变化与标准组相比皆由术前的长椭圆型Q值向扁椭圆型变化,但Q值调整的个体化组在角膜中央区的扁椭圆变化小于标准组,尤其在角膜中央3.5mm。说明Q值调整的个体化LASIK组在角膜中央区比标准组具有优势。     

中心粒周蛋白对胰岛素分泌的调节作用及其机制

目的:探讨中心粒周蛋白(pericentrin,PCNT)对胰岛素双相分泌的调节作用及其机制。方法:构建在小鼠胰岛β细胞中PCNT表达减少的转基因鼠(△PCNTβ小鼠),检测△PCNTβ小鼠与正常对照小鼠在给予糖耐量试验后第一时相和第二时相血糖和胰岛素分泌情况。检测两组小鼠胰岛内PCNT、胰岛素、纤维肌动蛋白(F-actin)变化情况,以及相关蛋白表达情况。结果:Western blot和RT-PCR显示△PCNTβ小鼠胰尾组织PCNT表达较对照组明显减低,免疫荧光提示△PCNTβ小鼠胰岛内PCNT、胰岛素表达较对照组明显减低。行腹腔注射葡萄糖耐量试验(Intraperitoneal glucose tolerance tests,IPGTT)△PCNTβ小鼠第一时相血糖曲线下面积(Quantification of area under the curve,AUC)显著高于对照组,第二时相血糖AUC两组小鼠间无统计学差异。△PCNTβ小鼠空腹胰岛素水平与对照组比较明显升高,葡萄糖刺激胰岛素分泌(Glucose stimulated insulin secretion,GSIS)后15min胰岛素增加值显著低于对照组,30 min和120 min时胰岛素水平与对照组无显著差异。Western blot显示△PCNTβ小鼠与对照组比较F-actin表达明显减低,ERK、p-ERK表达明显升高。RT-PCR测定△PCNTβ小鼠与对照组比较ETV4表达显著升高。免疫荧光提示△PCNTβ小鼠胰岛内F-actin和突触融合蛋白4(Syntaxin4,Syn-4)表达较对照组明显减低。结论:抑制小鼠胰岛β细胞内PCNT表达后,其通过抑制F-actin和Syn-4表达影响胰岛素分泌,导致空腹时胰岛素过度分泌和第一时相胰岛素分泌受损。     

QCM 监测自组装膜上心肌细胞黏附及其与心血管药物作用

目的:本试验采用石英晶体微天平(QCM)实时监测大鼠心肌细胞(H9C2)在含有细胞黏附识别多肽RGD自组装膜上的动态黏附过程及随后与两种心血管药物(一种正性肌力、另一种负性肌力)相互作用。方法:在金电极表面自组装3-巯基丙酸(MPA)单层膜,并经酰胺化共价耦合细胞黏附分子KRGD,形成对大鼠心肌细胞有特异性黏附的致密分子自组装膜。QCM以动态持续的方式实时监测MPA/RGD自组装及其不同浓度梯度H9C2细胞在自组装膜金电极上的细胞黏附过程。此外,选用20,000个H9C2细胞和正性肌力药物异丙肾上腺素、负性肌力药物维拉帕米,用QCM评估了细胞-心血管药物的相互作用。结果:与裸金电极相比,MPA/RGD修饰金电极增大了H9C2细胞黏附所引起的QCM频移(△f)与动态电阻变化(△R)响应。在所试H9C2浓度范围(5×10~4-4×10~5 cells/m L),△f与H9C2浓度呈线性关系,△R与H9C2浓度呈幂函数关系。我们用细胞粘弹性指数(CVI=△R/△f)来表征细胞的粘弹性。H9C2在异丙肾上腺素作用下,△f与△R增加、细胞-QCM表面黏附加强,细胞变硬;在维拉帕米作用下,△f与△R降低、细胞QCM表面黏附减弱,细胞变软。结论:QCM可用于不同浓度大鼠心肌细胞的动态细胞黏附监测,并可基于其细胞黏附与细胞黏弹性测定能力区分正性与负性肌力药物而可望用于心血管药物的筛选。     

大剂量rHuEPO治疗肾性贫血的临床研究

目的:探讨应用大剂量重组人促红细胞生成素(rnuEPO)治疗肾性贫血的效果及机制.方法:对38例处于慢性肾脏病(CKD)3～5期的贫血患者给予佳林豪1.2万IU皮下注射,每周1次,连续12周,同时补充铁剂、叶酸和维生素B12;骨髓穿刺进行铁染色和显微图像分析,比较治疗前后血清铁蛋白(SF)、血清铁(SI)及铁粒幼细胞计数,对总红系所占百分数(E(与SI、SF、红细胞压积(Hct)行相关分析,治疗前后取血检测红细胞压积(HCT)、RBC、血红蛋白(Hb).结果:治疗过程中大部分患者在EPO注射12周后HCT、RBC、Hb均比用药前有显著增高,骨髓红系增生较治疗前明显活跃,各类幼红细胞比率及E(总红系所占百分数)均显著升高,其中以晚幼红增生最为明显,SI、SF及铁粒幼细胞计数均明显降低,治疗前后骨髓△E%与血△RBC%、△HCT%呈高度正相关,△E%与△SF%、铁粒幼细胞计数变化率呈中度负相关,△E%与△SI%两者呈低度负相关.结论:大剂量重组人促红细胞生成素治疗肾性贫血效果显著.     

前肽缺失vWF促进细胞分泌蛋白质剪接的L303E／F309S突变体凝血第八因子

该文旨在探索前肽缺失von Willebrand子（vWF-△Pro）对蛋白质剪接的L303E／F309S突变体凝血第八因子（FVIII）分泌的影响。将vWF-△Pro基因与蛋白内含子融合的F聊重链和轻链基因共转HEK293胞。结果显示,转vWF－△Pro细胞的剪接蛋白FVIll分泌量和活性分别为（196±27）ng／mL和（1．39±0-31）IU／mL,明显高于对照细胞的（116±24）ng／mL和（0．91±0．18）IU／mL。表明vWF－△Pro可提高剪接的L303E／F309S突变体FVⅢ蛋白分泌量和活性。     

铜绿假单胞菌群体感应系统缺陷株生物膜形成和结构定量分析

目的研究群体感应(quorum sensing,QS)系统在铜绿假单胞菌生物膜(biofilm,BF)形成中的作用。方法体外建立QS系统完整的铜绿假单胞菌野生型PAO1菌株与QS系统缺陷(lasI rhlI基因缺陷△lasI△rhlI)型菌株生物膜模型,通过SYT09/PI荧光探针标记,结合激光共聚焦显微镜摄取BF不同层面的图片,经图像结构分析(ISA)软件分析获得QS系统lasI rhlI缺陷株、PAO1菌株BF相关空间结构参数。结果培养第3天PAO1菌株可形成较厚、有孔状通道的成熟BF结构,而△lasI△rhlI菌株仅形成明显稀薄的早期BF结构,△lasI△rhlI菌株的3 dBF厚度为(6.62±0.31)μm,PAO1菌株为(21.64±0.57)μm(t=0.205,P0.05),区域孔率(areal porosity,AP)分别为0.902±0.006、0.970±0.003;平均扩散距离(average diffusion distance,ADD)和结构熵(textural entropy,TE)在△lasI△rhlI菌株分别为1.571±0.019和6.586±0.110;在PAO1菌株分别为1.467±0.015和5.213±0.111,△la-sI△rhlI菌株AP较PAO1菌株低(t=0.335,P0.05);而ADD、TE较PAO1菌株高(t=0.289,t=0.300,P0.05)。结论lasI rhlI基因缺陷明显影响铜绿假单胞菌的BF形成能力,QS系统在铜绿假单胞菌BF形成中发挥重要作用。     

多姿洋兰喜迎春

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