极端嗜盐古生菌(Natrinema sp.)R6-5胞外嗜盐蛋白酶的纯化和性质研究

采用bacitracin-Sepharose 4B亲和层析的方法得到凝胶电泳均一的来自极端嗜盐古生菌(Natrinema sp.)R6-5的胞外嗜盐蛋白酶。经SDS-PAGE分析该酶亚基分子量为62kDa。PMSF对它的活性完全抑制,表明它是一种丝氨酸蛋白酶,该酶反应的最适NaCl浓度为3mol/L,最适温度为45℃,最适pH值为8.0。在高盐条件下能维持高活性并十分稳定,具有重要的潜在应用价值。     

嗜盐脂肪酶产生菌的筛选及其粗酶性质

从内蒙古锡林浩特地区盐湖菌种样品分离获得一株嗜盐脂肪酶高产菌, 结合生理生化试验和16S rDNA序列分析结果, 鉴定并命名为Haloterrigena thermotolerans Z4。该菌最适生长NaCl浓度为3.5 mol/L, 最高生长温度为60°C, 属于嗜盐耐热古生菌。粗酶性质研究表明, 金属离子(Ba2+、Fe2+、Cu2+)对酶有激活作用, 酶活不同程度的提高了20%~30%; 该酶受EDTA的抑制, 酶活下降了20%, 受PMSF的完全抑制。该酶对NaCl有较高的依赖专一性, 至少需要0.5 mol/L NaCl维持活性并且高浓度NaCl可以提高其耐热水平。醇类物质对于提高酶的热稳定性有一定作用, 丙三醇效果最好。该酶对短链底物对硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)的最适水解条件为：pH 8.0、70°C、3.5 mol/L NaCl; 而对长链底物对硝基苯酚十六酸酯(p-NPP)的最适水解条件为：pH 8.0、80°C、2.5 mol/L NaCl。     

嗜盐碱性淀粉酶产生条件和性质的初步研究

从我国内蒙古自治区察汗淖碱湖分离到一株能产胞外嗜盐碱性淀粉酶的极端嗜盐嗜碱杆菌(Natronobacterium sp.)C-212,该菌产酶的最适pH和NaCl浓度分别为9.5和20%,最适碳源为可溶性淀粉,氮源为复合蛋白胨.酶反应最适温度为50℃,pH为8.5,NaCl浓度为2.6mol/L,该酶在pH9.5最稳定,NaCl可增加酶的热稳定性,酶降解可溶性淀粉的主要产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖及其他寡糖.     

盐生植物盐地碱蓬酪氨酸酶的酶学特性

酪氨酸酶是植物甜菜素生物合成的限速酶,但是,其酶学特性尚不了解。以黑暗培养3d的盐地碱蓬幼苗为材料,采用NaF抽提、饱和硫酸铵沉淀法提取盐地碱蓬中的酪氨酸酶,以研究其酶学特性。结果表明,酪氨酸酶氧化活性的最适温度为35℃,最适pH值为6.6,最适条件下Km=1.09mmol·L-1,Vmax=71.43μmol·g-1（FW）·min-1;酪氨酸酶羟化活性的最适温度为40℃,最适pH值为6.6,最适条件下Km=3.16mmol·L-1,Vmax=0.645μmol·g-1（FW）·min-1。Na2S2O3是盐地碱蓬酪氨酸酶的强效抑制剂,0.05mol·L-1Na2S2O3几乎完全抑制酪氨酸酶氧化及羟化活性。而0.01mmol·L-1的Cu2＋可以显著激活酪氨酸酶的氧化及羟化活性,分别为对照的126%和128.2%。这些结果表明盐地碱蓬中酪氨酸酶的羟化活性是影响甜菜红素合成速率的关键,也为深入研究盐地碱蓬酪氨酸酶在甜菜素合成中的作用及其与环境之间的关系奠定了基础。     

巴西橡胶树胶乳磷脂酶A_2的分离纯化及部分酶学性质鉴定

通过丙酮沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶过滤柱层析等分离纯化技术,对巴西橡胶树胶乳C-乳清磷脂酶A2进行分离纯化。用SDS-PAGE测定其亚基的相对分子量。测定该酶最适温度和pH,动力学常数Km和Vmax。并测定Ca2+和La3+对酶活性的影响。结果显示:该酶被纯化了49.47倍,产率为5.12%。SDS-PAGE检测为单一条带,其亚基相对分子量约43kDa。最适反应温度为37℃,最适反应pH为8.0,Km为0.44mmol·L-1,Vmax为7.22μmol.(mL.min)-1。最适Ca2+浓度为50μmol·L-1,稀土元素La3+离子对磷脂酶A2活性有抑制作用,但加入Ca2+后可缓解La3+对磷脂酶A2活性的抑制作用。胶乳C-乳清磷脂酶A2与其他植物磷脂酶A2在Ca2+的依赖性上存在差异。研究结果为今后探索橡胶树胶乳磷脂酶A2的催化机理、调节机理及生理功能等奠定了基础。     

NaCl胁迫对姜黄组培苗生理特性的影响

以姜黄组培苗为试验材料,在继代培养基中分别添加0、25、50、75、100、125、150mmol·L-1NaCl进行盐胁迫处理,研究NaCl胁迫下姜黄幼苗生长和生理特性的变化。结果表明:NaCl胁迫下,姜黄组培苗的脯氨酸和丙二醛含量逐渐上升,而叶绿素和类胡萝卜素含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性逐渐下降。25 mmol·L-1NaCl时姜黄幼苗的基径、株高和鲜重与对照差异不显著,50 mmol·L-1NaCl时则显著下降;表明姜黄组培苗的生长可以耐受25~50 mmol·L-1NaCl胁迫。随着NaCl浓度增加,姜黄幼苗的可溶性糖和蛋白质含量、过氧化物酶(POD)活性先升高后降低,75 mmol·L-1NaCl时均达到最大值。50~100 mmol·L-1NaCl胁迫下姜黄叶片的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性和姜黄素含量得到显著提高,表明50~100 mmol·L-1NaCl胁迫对姜黄素的合成有促进作用。可见,25~50 mmol·L-1NaCl能够促进姜黄植株的生长,而75 mmol·L-1NaCl显著提高次生代谢产物姜黄素的含量。     

木薯华南8号组培苗对盐胁迫的生理响应

以NaCl胁迫生长的木薯(Manihot esculenta)华南8号(SC8)组培苗为材料,研究不同浓度(0、5、20、35、50 mmol·L-1及R50 mmol·L-1)NaCl处理对SC8组培苗的生长状况及叶绿素、过氧化氢(H2 O2)、丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的影响.结果表明:≤20 mmol·L-1的NaCl胁迫60 d对SC8组培苗的生长基本无影响;≥35 mmol·L-1的NaCl胁迫60 d抑制了SC8组培苗的生长,但高浓度(50 mmol·L-1)胁迫30 d后正常培养30 d,可以使SC8组培苗的长势得到恢复.叶绿素和MDA含量在≤35 mmol·L-1 NaCl处理下较对照出现积累现象,随NaCl浓度升高(≥50 mmol·L-1)含量开始下降;与对照相比,H2 O2含量在NaCl胁迫下未出现积累现象.NaCl胁迫下,POD、CAT和APX活性较对照均有所提高;较高浓度的NaCl处理下,SOD、CAT和APX活性开始降低.实时荧光定量PCR结果表明,≥50 mmol·L-1NaCl胁迫下,SOD、CAT、POD和APX的表达水平较对照出现上升现象.这说明短时间的盐胁迫不会对木薯造成致死伤害,可以通过调节生理指标的活性来提高木薯的耐盐性.     

蒺藜苜蓿叶片光合作用对盐胁迫的响应

为阐明蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)叶片光合效率对盐胁迫的响应规律,明确其土壤盐分阈值,该研究以盆栽蒺藜苜蓿幼苗为研究对象,采用加盐的方式人工模拟盐胁迫环境,设置不同浓度NaCl处理(0、50、100、150、200、250、300、400mmol·L-1),利用Li-6400便携式光合测定仪分析了蒺藜苜蓿幼苗光合效率参数对土壤盐分浓度的响应特征。结果表明:(1)蒺藜苜蓿叶片净光合速率(Pn)和光合作用特征参数等具有明显的土壤盐分临界效应。在NaCl浓度为100~200mmol·L-1时,蒺藜苜蓿可维持较高光合生产力,此盐分范围内适宜的光合有效辐射(PAR)为600~1 300μmol·m-2·s-1,出现Pn最大值(20.7μmol·m-2·s-1)的NaCl浓度为150mmol·L-1,对应PAR为1 200μmol·m-2·s-1左右。(2)在NaCl浓度150mmol·L-1时,随着NaCl浓度的增加,表观量子效率(AQY)、光补偿点(LCP)、暗呼吸速率(Rd)和最大光合速率(Pnmax)逐渐增大;在NaCl浓度为150mmol·L-1时,AQY、Rd和Pnmax分别达到最大值0.030、0.605 7μmol·m-2·s-1、19.4μmol·m-2·s-1,而LCP达到最小值19.8μmol·m-2·s-1。(3)NaCl浓度为150mmol·L-1可作为导致蒺藜苜蓿净光合速率下降的气孔限制和非气孔限制因素的转折点,并且随着NaCl浓度升高,其光合速率由气孔限制转为非气孔限制的PAR降低。以上结果表明,蒺藜苜蓿对盐胁迫具有较强的适应性,在较高盐分浓度下可获得较高的光合生产力。     

蒜粉中蒜氨酸酶的分离纯化及性质测定

蒜粉以Na/K磷酸缓冲液抽提、25%～40%(NH4)2SO4分级沉淀后,用Sephadex G-200柱分离得到纯化200倍的电泳纯蒜氨酸酶.测定其性质的结果表明,此酶在25℃下对半胱氨酸亚砜的Km为0.87 mmol·L-1,Vmax为0.46μmol·min-1,最适反应温度为40℃,热稳定性的温度范围在45℃以下,最适pH为6.6.     

假单胞菌N-13中丝氨酸羟甲基转移酶的酶学性质研究

从产L-丝氨酸菌株假单胞菌N-13中纯化了丝氨酸羟甲基转移酶,并对其性质进行了研究.结果表明,丝氨酸羟甲基转移酶酶活力在pH=7.0～9.0间稳定,最适宜pH=8.0;酶的最适温度为35℃,在30～40℃水浴30 min酶活力未见明显下降.磷酸吡哆醛的最适添加浓度为25 μmol·L-1.研究了不同金属离子对酶活力的影...     

棉铃虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

以棉铃虫Helicoverpa armigera蛹为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、Sephadex G-200分子筛柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰- β-D-氨基葡萄糖苷酶酶制剂。纯酶的比活力为2 678.79 U/mg。以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-β-D-GlcNAc)为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学。结果表明：酶的最适pH为5.63,最适温度为55℃。该酶在pH 4～8区域较稳定,而在pH>8时能迅速失去活力;在50℃以下处理30 min,酶活力仍保持稳定,高于50℃,酶很快失去活力。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.16 mmol/L,最大反应速度Vm为10.73 μmol·L^-1·min^-1。酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为66.24 kJ/mol。     

刺孢小克银汉霉氨基酰化酶拆分DL-丙氨酸的研究

选育了刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)9980菌株,并对其进行液体培养,比较了3种不同培养基中菌体细胞氨基酰化酶活性,考察了几种因素对菌体细胞拆分反应的影响,并对DL-丙氨酸进行了光学拆分。结果表明:蛋白胨培养基菌体细胞酶活最高,达680u/g。菌体细胞拆分反应最适温度55℃,最适pH7.0,最佳底物浓度为0.2mol·L-1,缓冲体系中的无机离子对拆分反应有抑制作用,10-3～10-4mol·L-1的Co2+对拆分反应有激活作用。用菌体细胞对DL-丙氨酸拆分反应中,D-丙氨酸得率平均达87.1%。     

黄连ISSR反应条件优化的研究

以黄连(味连,Coptis Chinensis Franch.)基因组DNA为模板,通过单因子、双因子实验研究了ISSR反应体系中主要成分（Mg²⁺、dNTP、引物、模板、Taq DNA聚合酶）以及热循环参数（退火温度、循环数、变性时间、退火时间、延伸时间）对扩增结果的影响,并找出各自的最适条件,建立了适合黄连ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25μL反应体系中,内含1×PCR buffer、1.5mmol·L^-1 Mg²⁺、200μmol·L^-1 dNTP、0.3 μmol·L^-1引物、40 ng模板、1 U TaqDNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环：94℃变性30 s,（据不同引物的退火温度）复性1 min,72℃延伸1.5 min,循环结束后72℃延伸7 min,-4℃保存。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术进行黄连鉴定及种质遗传多样性分析提供了一个标准化程序。     

2,4-二硝基氟苯衍生法测定游离氨基酸方法的优化

以美国HPLC 110 0系列为基本实验设备 ,在流速为 1 0ml/min ,紫外检测器波长为 36 0nm ,运行时间 2 5min ,进样量为 10ul情况下 ,筛选了流动相梯度、2 ,4_二硝基氟苯用量、柱温 ,测定了回收率。结果表明 :FDBN衍生法分析游离氨基酸 ,流动相Ⅰ为 0 0 4NKH2 PO4 ( pH =7 2± 0 0 5 ,40 %KOH调整 )缓冲液 ;流动相Ⅱ为乙腈的水溶液 ,其浓度为 5 5 % ,流动相Ⅰ的百分比梯度为 86 / 0min— 88/ 2min— 86 / 4min— 70 / 10min— 30 / 2 0min— 10 / 2 1min— 0 / 2 4.0min ,1%FDBN用量为 5— 2 0ul,柱温 40℃ ,样品AA浓度大于 0 5nmol/ul,17种AA分离效果最佳。此方法AA回收率在10 0 %～ 10 4%之间。     

正交设计优化北重楼ISSR-PCR体系

利用正交试验设计L₉(3⁴)的方法,最终建立了北重楼ISSR-PCR的优化反应体系,即20 μL反应体系中包含1×buffer,dNTP 175 μmol·L^-1,Primer 0.8 μmol·L^-1,Mg²⁺ 1.4 mmol·L^-1,Taq酶2.5 U及模板DNA 80 ng。适宜的扩增程序为95℃预变性5 min;94℃变性40 sec,55℃退火45 sec,72℃延伸90 sec,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。该优化体系的建立,将为北重楼及其近缘种的系统学和种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

林生山黧豆谷氨酸脱羧酶的分离纯化及部分性质的研究

以林生山黧豆为材料,利用硫酸按分段盐析,丙酮沉淀,DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析,SephacrylS300凝胶过滤柱层析及FPLC-MonoQ柱层析技术,以聚酰胺薄膜层析荧光定量法为酶活力检测手段,分离纯化了谷氨酸脱羧酶,达到电泳银染纯．纯化后的林生山黧豆谷氨酸脱羧酶活力达375．09U·mp-1,纯化倍数38．2倍,经SDS-PAGE测定,其亚基分子量为70kD,经梯度PAGE确定,天然分子量为140kD,表明该酶是由两个亚基组成的二聚体．酶学研究表明,纯化的林生山黧豆谷氨酸脱羧酶的最适pH值为5．4,对谷氨酸的Km值为1．62×10-3mol·L-1,酶的最适温度为40℃,酶特异性地使谷氨酸脱羧,不能使天门冬氨酸等其它氨基酸脱羧．     

酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶的诱导、提纯和性质

在YEPD培养基中添加NaCl,可以诱导酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞内3-磷酸甘油脱氢酶的形成,当NaCl浓度达5％时,酶比活从0.05U/mg提高0.5U/mg;若再限制培养墓中葡萄糖浓度在100mg/L以下,酶比活可达到0.89U/mg。酶比活与培养基中的NaCl浓度的函数关系式为:Sa=0.129C~3-0.038C~2+0.034C+0.063(0≤C≤5％)。粗酶液经Sephadex G-25凝胶过滤,Blue Sepharose亲和层析以及Mono Q离子交换等步骤,提纯123.6倍,得纯酶液。经SDS-凝胶电泳测得分子量为45000±2000。酶的最适温度为51℃,最适pH值为6.8。保温30分钟的半失活温度(t_(1/2))为41℃。NADH和DHAP的Km(mmol/L)值分别为:0.017和0.134。     

萝卜基因组DNA的RAMP-PCR体系优化

以萝卜为材料,对基因组DNA的RAMP分析体系中的Mg²⁺、dNTPs和引物浓度进行优化。分别设计3个浓度梯度：Mg²⁺为 0.75、1.5、3.0 mmol·L^-1;dNTPs为 0.05、0.15、0.3 mmol·L^-1;引物为 0.065、0.2、0.4 μmol·L^-1,并对合适退火温度进行研究。筛选出的RAMP优化体系为(20 μL):dNTPs 0.15 mmol·L^-1,Mg²⁺ 1.5 mmol·L^-1,引物0.2～0.4 μmol·L^-1,DNA 10 ng,Taq E 0.8U;PCR扩增程序为94℃ 3 min,94℃ 1 min,45℃ 1 min,72℃ 1.5 min,42个循环, 72℃ 8 min。运用此体系,进行引物组合筛选,并对7个萝卜品种的遗传多样性与品种鉴定进行RAMP标记分析。     

乌塌菜ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为获得乌塌菜ISSR-PCR的最佳反应体系,采用单因素浓度梯度试验和正交优化设计相结合的方法,研究了引物浓度、dNTP浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶用量对PCR反应的影响。并在此基础上对退火温度和循环数进一步优化,最终确立了适合乌塌菜ISSR PCR反应的最佳体系和程序。即20 μL PCR反应体系含：30 ng模板DNA,0.50 μmol·L^-1引物,0.25 mmol·L^-1 dNTP,1 mmol·L^-1 Mg²⁺,1.0 U Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术对乌塌菜进行种质资源的分类鉴定奠定了基础。