I型马立克氏病毒38kD磷蛋白与Ⅱ和Ⅲ型病毒间的交叉免疫反应

由致病性Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)特异性的单克隆抗体H_(19)制备亲和层析柱,从感染重组杆状病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞系Sf9细胞中提纯MDV的pp38基因表达产物,以此免疫小鼠制备抗血清,测定其与不同型MDV毒株感染的鸡胚成纤维细胞免疫反应性,同时也用不同型MDV毒株(HVT,Z4)制备的抗血清和自然感染发病鸡血清分别与感染重组病毒的Sf9细胞进行免疫交叉反应.试验结果表明,完整的Ⅰ型MDV来源的pp38基因产物与所试Ⅱ型Z4株和Ⅲ型HVT Fc126毒株在抗原性上有显著交叉反应.这一结果表明,在Ⅱ型和Ⅲ型MDV毒株中可能存在着pp38的类似物.     

单克隆抗体与抗血清联合应用建立血清CMLC测定方法的研究

单克隆抗体(McAb)和抗血清各有特点。本文提纯人心肌肌球蛋白轻链(CMLC)并制备其单克隆抗体和抗CMLC兔血清(下称抗血清),试建立测定血清CMLC的酶联免疫(ELISA)方法。通过比较,McAb和抗血清联合应用可提高测定方法的灵敏度和特异性;并对各反应试剂的工作浓度进行确定,建立了McAb(1C_(11)-D_7株)为铺底抗体,抗血清为覆盖抗体,碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG为第三抗体的三抗体酶联免疫夹心测定血清CMLC的方法(MP-ELISA)。血清CMLC最小可测浓度为2.5ng/mL。     

番木瓜环斑病毒单克隆抗体的制备及在病毒分型上的初步应用

本试验是用番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus, PRV)提纯制剂免疫的BALB/c小白鼠脾细胞与Sp~2/o-Ag14骨髓瘤细胞融合,获得三个能稳定传代并分泌抗番木瓜环斑病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中23H1 McAb的效价较高,用ELISA检测,腹水抗体效价高达1:76800,能被PRV兔抗血清所阻断。这3个杂交瘤细胞系产生的单抗与TMV和CMV无血清交叉反应。它们可把PRV四个毒株初步区分为三个血清型。     

抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:制备抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体。方法:采用杂交瘤技术,获得2株针对重组黄曲霉尿酸氧化酶(rUOX)的杂交瘤细胞McAb17和McAb3;采用盐析和A蛋白亲合层析柱纯化该抗体。结果:McAb17和McAb3的腹水效价达到1∶512000,纯化后获得纯度大于95%的单抗,抗体亚类(型)分别为IgG1/k型和IgG2a/k型;ELISA结果显示制备的单抗与rUOX和Rasburicase(商品化rUOX)可发生特异反应。结论:制备了抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体McAb17和McAb3,为检测rUOX在动物体内的代谢变化提供了良好的实验基础。     

马IgM、IgG单克隆抗体的研制与鉴定

以马IgM、luG作为免疫抗原,以此免疫BALB/c小鼠,并取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2.0)融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选,结果获得了4株分泌抗马IgM和2株分泌抗IgG的单克隆抗体的杂交瘤细胞,特异性试验证明,4株IgM单抗有很好的特异性,仅与马的IgM特异反应,而不与IgG反应;这4株单抗分别命名为IgM4H、IgM6B、IgM8A和IgM12F.经鉴定,IgM4H、IgM6B、IgM12F株为IgG1亚类,IgM8A株为IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条.杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA都具有较高的效价,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体.2株IgG的单克隆抗体有很好的特异性,只与IgG反应,而不与IgM发生交叉反应.     

SARS-CoV-2重组S1和S蛋白疫苗诱导保护性免疫的研究*

目的:评价新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组S1蛋白和S蛋白疫苗对SARS-CoV-2的免疫保护效果。方法:将SARS-CoV-2重组S1蛋白和S蛋白分别联合氢氧化铝佐剂以0.1 μg/只、1 μg/只、5 μg/只、10 μg/只不同剂量接种6~8周BALB/c纯系健康雌性小鼠。第二次免疫后采血通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IgG抗体效价,通过假病毒中和试验比较免疫小鼠血清对SARS-CoV-2野生型株(WT)、英国株(B.1.1.7)、巴西株(P.1)、印度株(B.1.617.2)、Mu毒株(B.1.621)和南非株(501Y.V2-1)六种假病毒毒株中和活性效价,取脾细胞通过酶联免疫斑点技术(ELISpot)检测免疫小鼠的细胞免疫水平。结果:SARS-CoV-2重组S和S1蛋白都能诱导小鼠产生较强的IgG抗体水平。免疫S1蛋白的小鼠血清对SARS-CoV-2野生型株、英国株、巴西株有明显的中和活性,免疫S蛋白的小鼠血清除了对SARS-CoV-2野生型株、英国株、巴西株有明显中和活性之外,对印度株也有明显的中和活性,两种蛋白质免疫的小鼠血清均对野生型株中和效果最强。S蛋白免疫的小鼠脾细胞能够显著诱导出γ干扰素(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)的产生。S蛋白诱导产生的IgG抗体、中和抗体、细胞免疫水平均高于S1。结论:SARS-CoV-2重组S蛋白疫苗能够诱导产生较强的保护性免疫应答。     

烟草花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用TMV免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,获得10株能稳定传代並分泌抗烟草花叶病毒(TMV)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,其中T73McAb滴度最高,ELISA滴度高达1/655,360,能被TMV兔免疫血清所阻断,能中和TMV的感染性。但与其它植物病毒无交叉反应,与TMV不同毒株均有反应。     

小鼠抗食蟹猴IgG单克隆抗体的制备

目的制备抗食蟹猴、恒河猴等非人灵长类实验动物免疫球蛋白二级抗体,开展对其传染病血清学快速诊断方法的建立。方法采用饱和硫酸铵盐析、Agarose-Protein G亲和层析技术,从食蟹猴血清中提纯IgG。经SDS-PAGE电泳鉴定,采用常规法免疫C57BL/6小鼠,三次免疫后取脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞通过PEG4000融合制备杂交瘤细胞,利用间接ELISA、Western blot等方法进行筛选、鉴定。结果得到5株阳性杂交瘤,分别命名为2B6、2B7、2D9、3B2、5E4,并且5株杂交瘤分泌的抗体均与恒河猴的IgG或血清发生交叉反应,而与其他物种如东北虎、犬等动物的IgG或血清无交叉反应。结论 5株杂交瘤产生的单克隆抗体（McAb）具有较好免疫活性,且能长期、稳定地分泌抗体。此项研究工作为后续研究食蟹猴、恒河猴传染病血清学诊断方法奠定基础。     

单克隆抗体对鼻疽和类鼻疽病原抗原及其血清学鉴别诊断的实验研究

应用抗鼻疽杆菌和抗类鼻疽杆菌的单克隆抗体(McAb),以间接ELISA,IFA以及免疫组织化学(下简称免疫组化)等技术方法,对来自不同地区的鼻疽杆菌(Ps.mallei)和类鼻疽杆菌(Ps.pseudmallei)的表面抗原进行了分析。在此基础上,又对鼻疽(Mallcus)和类鼻疽(Melioidosis)之间的血清学鉴别诊断等问题进行了研究。试验结果表明：(1)鼻疽杆菌和类鼻疽杆菌各自表达了不同的表面抗原反应类型,其闻并有一定的交叉关系;(2)鼻疽杆菌和类鼻疽杆菌各株均与McAb 2D4发生反应,说明表位2D4很可能为二菌所共有;(3)McAb4D4和lA9的类似抗体在鼻疽和类鼻疽血清都表现了较高的出现频率,说明其可能为二种血清的共有抗体成份;(4)McAb 3A1是仅同类鼻疽杆菌各株发生反应的特异性抗体。应用该McAb,以相应的实验技术,有可能解决长期以来存在的鼻疽和类鼻疽菌体间和血清间的免疫学鉴别诊断问题。     

抗Ⅰ型马立克氏病毒sorf2蛋白的多克隆抗体制备及其特异性鉴定

[目的]制备高效价鼠和兔抗Ⅰ型马立克氏病毒(Marek's disease virus,MDV) sorf2蛋白的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定.[方法]以Ⅰ型MDV GX0101为模板,利用PCR扩增sorf2基因,分别克隆进原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (Rosetta),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导后进行融合蛋白的表达和纯化.用纯化的融合目的蛋白常规免疫6-8周龄Balb/c小鼠和成年新西兰大白兔,制备抗sorf2蛋白的多克隆抗体.用Western blot和间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性.[结果]Ⅰ型MDV的sorf2基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠和兔后能获得与sorf2蛋白发生特异性反应的高效价的多克隆抗体.[结论]制备的抗sorf2蛋白的多克隆抗体能够特异的鉴定MDV sorf2基因缺失株,有效的区分MDV疫苗株HVT(FC-126)与Ⅰ型MDV毒株,用于临床MDV野毒的分离鉴定.     

Monoclonal antibodies with specificity for three different serotypes of Marek's disease viruses in chickens

A total of 50 antibody-secreting hybridoma cells against Marek's disease virus (MDV) and turkey herpesvirus (HVT) have been produced. Eleven hybridomas were used for serotyping a panel of 15 pathogenic and nonpathogenic strains of MDV and HVT, representing three serotypes. The antibodies from the culture medium have fluorescence antibody (FA) titers of up to 100 and those from mouse ascitic fluid have titers ranging from 10(4) to 10(6). Monoclonal antibody T81 is type-common, i.e., it reacts at equal titer with all MDV and HVT tested. Of the remaining 10 antibodies, eight react only with pathogenic and attenuated strains of MDV (presumably serotype 1), one reacts only with nonpathogenic MDV (presumably) serotype 2), and one reacts only with strains of HVT (presumably serotype 3). Two hybridomas belong to IgG2a and IgG2b subclasses, respectively, and the remaining nine belong to IgG1 subclass. None of the antibodies specific for MDV strains reacted with homologous viruses in serum neutralization (SN), agar gel precipitin (AGP), or membrane immunofluorescence tests. Antibody L78, which is specific for HVT, was reactive with its homologous virus in the SN test; antibody from the culture medium showed an SN titer of 10 and that from mouse ascites a titer of 10,000. None of the antibodies specific for MDV or HVT reacted with other avian or mammalian herpesviruses, avian leukosis viruses (ALV), reticuloendotheliosis viruses (REV), or Marek's disease tumor-associated surface antigen (MATSA) expressed in a lymphoblastoid cell line, MDCC-MSB-1.     

白背飞虱单克隆抗体的制备及其特性的研究

应用杂交瘤技术,制备出4株高度特异性的白背飞虱单克隆抗体,分别命名为WPH-1H9、WPH-2B6、WPH-2E12和WPH-3F12。这些抗体与其它8种昆虫未发生交叉反应,其中WPH-2B6可与白背飞虱所有虫态发生反应,其余3株只与卵和雌成虫发生反应。应用免疫双扩散法鉴定抗体类型及亚类,结果表明：WPH-2B6为IgG_2b亚类,其余均为IgG₁亚类。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot印迹分析表明,白背飞虱抗原主要由分子量分别为182、116、66.2及40 kD的4个多肽组成,其中WPH-2B6与182、116 kD的多肽结合,其余3株的单抗只与116 kD的多肽具有亲和性。最后对这些单克隆抗体在捕食作用研究中的应用潜力进行了讨论。     

抗人IL-6单克隆抗体的制备及鉴定

用基因重组人IL-6免疫Balb/c小鼠,采用小鼠杂交瘤技术,筛选克隆到分泌抗人重组IL-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其中2H₂、 1D₂ 和4B₄瘤细胞株进行了鉴定.其抗体类别均为IgG,亚类分别为IgG1和IgG2a.用多种细胞因子和无关蛋白的鉴别试验结果证实它们均特异地识别rhIL-6.免疫转染结果显示,该单抗识别分子质量为21 ku的IL-6单一条带.IL-6单克隆抗体的亲和常数K_aff= 1.62×10⁹ (mol/L)^-1.     

Comparison of indirect immunofluorescence (IF) test with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in screening of hybridomas to very virulent Marek's disease virus.

For identifying virus-specific antigens of Marek's disease virus (MDV), monoclonal antibodies (MAbs) against strain Md5 of serotype 1, which is known to be a very virulent MDV (vvMDV), were isolated. Fifty-eight hybridoma clones that secreted MAbs against vvMDV were obtained. Of these MAbs, 36 gave positive reactions in an immunofluorescence (IF) test, and 22 gave positive reactions on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). None of these MAbs gave positive reactions in both the IF test and ELISA. Of the MAbs that gave positive reactions in the IF test, 33 clones reacted with MDV1-specific epitopes, the other three reacting with MDV1-HVT intertypic epitopes. None of the clones reacted with MDV1-MDV2 intertypic epitopes. Three virus-specific polypeptides were identified by radioimmunoprecipitation and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) or immunoblotting. These polypeptides were recognized by 12 MAbs giving positive reactions by IF, but by none of those giving positive reactions by ELISA. In addition, size heterogeneity of the MDV1-specific phosphorylated polypeptides in the MDV1 strains was shown using the MAbs against Md5.     

重组恶性疟原虫DNA质粒免疫小鼠制备单克隆抗体

用恶性疟原虫MSP131基因片段的重组质粒DNA直接免疫BALB/c小鼠,诱导产生体液,免疫后取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG1450作用下进行融合,获得了2株能分泌抗恶性疟原虫MSP131单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株9H9和8A2。用酶联免疫吸附试验检测,小鼠腹水抗体滴度最高为1∶10 000。经免疫球蛋白类型和亚类鉴定,2株杂交瘤细胞株均为IgG\-1\.蛋白免疫印迹试验表明,此单克隆抗体与MSP1\|31蛋白抗原有特异免疫反应,证明通过质粒DNA直接免疫小鼠可制备特异性单克隆抗体。     

抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:获得分泌抗H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。方法:以H9N2亚型AIV为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14,在PEG4000的作用下进行细胞融合,通过血凝抑制(HI)试验筛选分泌抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果:经过连续3～4次克隆化,获得能稳定分泌抗H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体细胞系6株,分别命名为1B2、1C10、1G2、2B7、2E3和5E11。6株细胞培养上清HI效价为24～28,腹水HI效价为210～213。除1G2为IgM外,其余5株均为IgG1。Western blotting结果显示,1B2、1C10、2B7和2E3能与AIVH9蛋白在Mr为75000处反应,表明其是针对AIVH9亚型血凝素蛋白的单抗。特异性试验表明该6株单抗均只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他14个HA亚型的AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性。结论:制备了针对H9亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,为禽流感的快速诊断和病毒的抗原性分析等奠定了基础。     

利用细菌人工染色体技术构建整合F基因的重组MDV疫苗株*

目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性基因片段的F基因,采用同源重组的方法将其整合到CVI988 BAC上,进一步诱导I-SceI表达敲除Kana基因而获得重组质粒CVI988 BAC-F。通过磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞获得重组病毒。结果:Western blot和间接免疫荧光实验证实重组病毒能够表达F蛋白。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果表明,F基因的插入不影响病毒的体外增殖。结论:利用BAC技术成功构建了整合F基因的重组MDV病毒CVI988 BAC-F,为MDV重组疫苗研发,防控NDV与MDV共感染奠定了基础。     

抗乙型肝炎病毒e抗原和核心抗原双特异性单克隆抗体的建立与应用

用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达的乙型肝炎病毒核心抗原(内含高滴度的e抗原)免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)融合,获得两株分泌高滴度既抗-HBe又抗-HBc的双特异性杂交瘤细胞系。细胞培养上清液中抗体滴度为100～1000以上;免疫腹水中的抗体滴度为8万至10万以上,均属IgG2a亚类。细胞在实验室连续传代二年多,仍保持高效分泌抗体能力。此单克隆抗体与HBeAg或HBcAg的结合可被抗-HBc或抗-HBc阳性血清所抑制,竞争抑制率在85.9％～96.8％之间。用此单克隆抗体与HBe的β型单克隆抗体和抗HBc的α型单克隆抗体配对,可组装成检测HBeAg/抗-HBe和抗-HBc的诊断试剂,具有重要的应用价值。     

接种不同毒力的马立克氏病病毒后鸡病毒血症的动态比较

1日龄非免疫鸡分别接 马立克氏病病毒（MDV）Ⅰ强毒GA株、Ⅰ型MDV疫苗毒CVI988株和Ⅲ型火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗株后第4日起,定期采血并和抗MDV囊膜糖蛋白B(gB)单克隆抗体介导的间接免疫荧光试验检测MDV在外周因液单核细胞（PBMCs）中的感染状况。结果发现,自接种Ⅰ型强毒GA株后第4日至鸡发病死亡前,都能检出GA株引起的病毒血症,并于2周左右达到高峰;自接种CVI988株后第4日至第20日止,能检出病毒血症,并于第8天左右达到高峰;自接种HVT后第4日至第16日止,能检出病毒血症,并于第6天左右达到高峰。与此同时,将GA株病毒血症的IFA检测结果与细胞培养上病毒空班计数试验结果比较,发现IFA试验比空斑计数试验更为敏感。本试验既可用于判断对鸡作MDV疫苗免疫的接种效果,又可用于检测MDV野毒感染状态。     

The genome of turkey herpesvirus

Here we present the first complete genomic sequence of Marek's disease virus serotype 3 (MDV3), also known as turkey herpesvirus (HVT). The 159,160-bp genome encodes an estimated 99 putative proteins and resembles alphaherpesviruses in genomic organization and gene content. HVT is very similar to MDV1 and MDV2 within the unique long (UL) and unique short (US) genomic regions, where homologous genes share a high degree of colinearity and their proteins share a high level of amino acid identity. Within the UL region, HVT contains 57 genes with homologues found in herpes simplex virus type 1 (HSV-1), six genes with homologues found only in MDV, and two genes (HVT068 and HVT070 genes) which are unique to HVT. The HVT US region is 2.2 kb shorter than that of MDV1 (Md5 strain) due to the absence of an MDV093 (SORF4) homologue and to differences at the UL/short repeat (RS) boundary. HVT lacks a homologue of MDV087, a protein encoded at the UL/RS boundary of MDV1 (Md5), and it contains two homologues of MDV096 (glycoprotein E) in the RS. HVT RS are 1,039 bp longer than those in MDV1, and with the exception of an ICP4 gene homologue, the gene content is different from that of MDV1. Six unique genes, including a homologue of the antiapoptotic gene Bcl-2, are found in the RS. This is the first reported Bcl-2 homologue in an alphaherpesvirus. HVT long repeats (RL) are 7,407 bp shorter than those in MDV1 and do not contain homologues of MDV1 genes with functions involving virulence, oncogenicity, and immune evasion. HVT lacks homologues of MDV1 oncoprotein MEQ, CxC chemokine, oncogenicity-associated phosphoprotein pp24, and conserved domains of phosphoprotein pp38. These significant genomic differences in and adjacent to RS and RL regions likely account for the differences in host range, virulence, and oncogenicity between nonpathogenic HVT and highly pathogenic MDV1.