外切体研究进展

外切体是酿酒酵母中鉴定的一个保守复合体,具有3′外切核酸酶的活性.10个核心亚基,除Csl4p/Ski4p外,在体外都具有3′外切核酸酶的活性.外切体在多种RNA的代谢中起重要作用.外切体普遍存在于真核生物中,并与真核基因的表达调控密切相关.     

核酸外切酶Ⅷ截短体的重组表达及其在体外DNA重组反应中的应用

核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Truncated exonucleaseⅧ,tExoⅧ)的重组表达载体pET28a-tExoⅧ,实现了tExoⅧ在大肠杆菌中的高效表达,在纯化获得高纯度蛋白的基础上,对体外重组反应的温度、反应时间、同源臂长度等因素进行了优化分析。研究结果表明,tExoⅧ在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,每升可纯化92.40 mg tExoⅧ,比活力为1.21×10~5 U/mg;在10μL的重组体系中,2.5 U的tExoⅧ于25℃反应12.5min随后50℃保温50 min时重组效率最高。添加Pfu DNA聚合酶的体外同源臂延伸策略可以有效提高重组克隆的效率。以转化效率为2.2×10~6 CFU/μg的Mach1T1为受体细胞,对于含有21 bp同源臂的1 kb片段与5.8 kb线性化载体的重组,每微克载体可形成1.1×10~4个重组克隆,且阳性率大于80%。同源臂长度在8–21bp范围内,重组反应效率随着同源臂长度增加而提高。在最佳反应条件下,同源臂长度仅为8bp仍可实现有效的重组反应。ExoⅧ介导的体外重组体系具有酶制备方法简单、对DNA的克隆无酶切位点限制及高重组克隆效率等显著优点,是分子生物学领域具有潜在应用价值的高效基因克隆新体系。     

真核生物中的微小RNA及其功能研究进展

真核生物中存在两种主要的非编码RNA(non-coding RNA),在真核生物中发挥重要作用。一类为微小RNA(microRNA,miRNA),另一为小干扰RNA(siRNA)。miRNA大小为19～25nt,在体内与蛋白质形成核糖核蛋白复合体(miRNP),在真核基因的表达调控,生长发育中起重要作用。siRNA在RNA干扰(RNA地 interference,RNAi)途径中起定位特异mRNA的作用。miRNA与siRNA有联系也有区别。miRNA在真核生物中的调控机制具有保守性。     

发光核酸适配体的筛选及应用

发光核酸适配体(light-up nucleic acid aptamers,LNAs)是一类能够特异性结合目标分子并增强目标分子发光性能的功能核酸(functional nucleic acids,FNAs)。LNAs具有组成简单、结构稳定、表达时间短等优点,因此在细胞成像、物质检测等传感领域显示出巨大潜力。随着对细胞内基因原位分析的研究深入,现存胞内成像技术的不足逐渐显露,LNAs成像系统应运而生。本文梳理并概括了不同类型LNAs的筛选方法,并从胞内、体外两个方面对LNAs的前沿应用进行了分析,指出了当前LNAs研究以及传感系统存在的不足,展望了LNAs在无细胞传感中的巨大发展前景,以期能够促进LNAs系统成为胞内外传感研究的一件利器。     

一种基于核酸外切酶Ⅲ的PCR产物克隆方法

基因克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的基因克隆中,一般利用限制性内切酶对DNA片段进行消化,然后使用DNA连接酶完成连接,因此这种方法受到插入片段和载体酶切位点的限制。一些ligase-free克隆技术虽然克服了酶切位点的限制,但费时费力,成本较高。为了弥补其他ligase-free技术的不足,文中介绍了一种新的利用核酸外切酶Ⅲ进行ligase-free克隆的方法,反应时间仅需要30 min,提高了克隆效率并有效降低经济成本,有利于大规模基因克隆的应用。     

DNA末端构型调控RecJ核酸外切酶活性

目的 核酸酶介导的DNA双链末端切割对同源重组修复至关重要。然而,DNA末端构型对RecJ 5’-3’核酸外切酶活性的调控尚不清楚。本研究旨在探究DNA3’端和5’端构型对RecJ核酸外切酶活性的影响及其机制。方法 为探究DNA3’端构型对RecJ核酸外切酶活性的影响,使用含有Mg²⁺的体系,对具有不同3’突出末端长度（9 nt与18 nt）和3’突出末端修饰（磷酸化和硫代磷酸酯修饰）的单链DNA分别进行RecJ核酸酶活性检测。为揭示DNA 3’端构型对RecJ外切酶活性的调控机制,在Mg²⁺缺失的体系中,使RecJ与底物结合后进行凝胶迁移实验（EMSA）。为探索其他调控因子与DNA3’端构型对RecJ的协同作用,分别检测5’端磷酸化修饰和单链DNA结合蛋白（SSB）对DNA3’突出末端修饰的影响。结果 DNA3’端构型包括突出末端的长度和修饰（磷酸化和硫代磷酸酯修饰）均会抑制RecJ外切酶活性。DNA 3’端磷酸化和硫代磷酸酯修饰通过重塑RecJ-DNA的结合模式抑制RecJ外切酶活性。DNA 5’端磷酸化修饰可增强RecJ对具有不同3’端...     

核酸适配体介导的肿瘤免疫治疗研究进展

肿瘤免疫治疗是一种新的肿瘤治疗方式,在临床治疗中具有重要意义和应用前景,主要包括过继性细胞免疫治疗、肿瘤疫苗和抗体肿瘤免疫治疗。抗体在肿瘤免疫治疗中应用广泛,但其价格昂贵,质量易受不同批次的影响且存在免疫原性。核酸适配体(aptamer)是一类能与靶标高特异性高亲和力结合的短的单链寡核苷酸,素有“化学抗体”之称。核酸适配体易合成且成本低,质量稳定且免疫原性低,基于这些优势近年来也被开发用于肿瘤免疫治疗。本文综述了核酸适配体在肿瘤免疫治疗中的进展,主要包括核酸适配体通过靶向免疫检查点、共刺激受体、细胞因子、递送小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA),间接调控肿瘤免疫进程,以及将核酸适配体修饰于细胞膜上直接介导免疫细胞靶向杀伤等。核酸适配体以多种方式在肿瘤免疫治疗中发挥作用,有潜力被开发用于临床治疗。     

真核生物细胞中无终止密码mRNA的降解

2002年,Frischmeyer和Hoof等人发现真核生物细胞中具有一种新的mRNA监视机制——无终止密码mRNA降解途径,与正常mRNA和无义mRNA降解途径不同,无终止密码mRNA是在外切酶体介导作用下快速脱腺苷并进行3’→5’方向的水解。本对无终止密码mRNA降解途径的研究现状做一简要介绍。     

核酸适配体在感染性疾病诊治中的研究进展

临床上,感染性疾病由于诊断不明或诊断时间较长导致严重后果的情况并不罕见。近年来,由于新型病原体感染报道层出不穷,现有病原体出现耐药也十分普遍,导致感染性疾病的诊断和治疗仍是临床上亟待解决的难题。核酸适配体是通过体外反复筛选或指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选出来的一类具有特异性识别能力的寡核苷酸序列,具有靶向结合目标分子的能力,可用于病原体检测和新型治疗性药物的开发。适配体已在感染性疾病诊治中显现良好的应用前景,进一步推进相关研究有望为感染性疾病的诊治提供新的途径。     

Exosome isolation from hemolymph of Korean rhinoceros beetle,Allomyrina dichotoma (Coleoptera: Scarabaeidae)

Exosomes are 30–150 nm vesicles that are secreted from a range of cells. Recently, exosomes have been the subject of considerable research because there is mounting awareness of their diverse functions, including a role in cell–cell communication and presenting pathogens for immune responses. Exosomes contain diverse nucleic acid and protein cargos, derived not only from the organism but also from pathogens, making them suitable for use in disease diagnosis. The Korean rhinoceros beetle, Allomyrina dichotoma (Coleoptera: Scarabaeidae), is commercially reared in Korea for the pet trade and is used in traditional medicine for liver‐related diseases. However, several insect diseases caused by bacteria, fungi and viruses have been reported in A. dichotoma mass‐rearing facilities. Identifying these diseases with accuracy and in a timely manner is of paramount importance. Such diagnosis can be accomplished by identifying the nucleic acid or amino acid fragments from these disease‐causing pathogens in the exosome of A. dichotoma. We isolated exosomes from the hemolymph of A. dichotoma and used them to analyze exosome RNA and proteins. We confirmed the isolation of exosomes through RNA profiling, protein analysis and Western blotting. Our research established a solid foundation for using insect exosome protein and RNA analyses for the accurate diagnosis of insect diseases. To our knowledge, this is the first report of exosome isolation from insect hemolymph.     

真核生物减数分裂重组热点的研究进展

真核生物减数分裂过程中基因组中某些区域会发生较其他区域高的重组频率,这些区域被称作减数分裂重组热点。该现象首先在酵母的研究中发现,重组区域因含有启动重组的特异位点,从而使基因组中呈现出重组不均匀分布的特征。重组热点还在真菌、玉米和人类等真核生物中发现。本文列举了不同真核生物体中具有代表性鉴别重组热点的方法,总结了目前减数分裂重组热点的研究现状,探讨了引起真核生物减数分裂交换活跃的因子和机制,并就当前存在的问题和今后发展的前景进行了讨论。     

Exosome biogenesis,secretion and function of exosomal miRNAs in skeletal muscle myogenesis

Exosomes are membrane‐bound extracellular vesicles that are produced in the endosomal compartment of most mammalian cell types and then released. Exosomes are effective carriers for the intercellular material transfer of material that can influence a series of physiological and pathological processes in recipient cells. Among loaded cargoes, non‐coding RNAs (ncRNAs) vary for the exosome‐producing cell and its homeostatic state, and characterization of the biogenesis and secretion of exosomal ncRNAs and the functions of these ncRNAs in skeletal muscle myogenesis remain preliminary. In this review, we will describe what is currently known of exosome biogenesis, release and uptake of exosomal ncRNAs, as well as the varied functions of exosomal miRNAs in skeletal muscle myogenesis.     

外泌体及其在肿瘤诊疗中的意义

外泌体(exosome)是由多种活细胞分泌的囊泡小体,其中含有蛋白质和RNA等多种组分。这种机体内普遍存在的纳米级被膜结构能够参与细胞间的物质交换和信息交流,在多种生理和病理过程中发挥重要作用。外泌体在外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等体液中具有很高的丰度,而不同组织来源的外泌体在组成和功能方面存在差异,同时这种差异受到细胞外基质和微环境的动态调控。肿瘤来源或肿瘤相关的外泌体是调控肿瘤发生发展的重要机制,对肿瘤外泌体的分析和检测可以辅助肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析。此外,外泌体及其修饰加工产物还可以作为基因或药物的有效载体,用于肿瘤治疗。关于外泌体的研究是肿瘤学的一个新兴领域,在转化医学的研究模式下,将极大推动肿瘤学研究进展,为肿瘤临床诊断和治疗带来新的契机。     

单细胞真核生物的miRNA系统及其进化意义

miRNA 系统在高等多细胞真核生物中得到了广泛深入的研究。近年来,人们在单细胞真核生物上的miRNA研究也取得了重要进展。这不仅丰富了人们对miRNA在整个生物界中的认识,更重要的是对于揭示miRNA这一表达调节系统是如何在生物界中起源进化的问题具有重要意义。该文结合作者在最低等单细胞真核生物——贾第虫上的研究结果,对该领域的研究进展作一概述,并对有关miRNA这一系统的起源进化问题进行了探讨。     

端粒酶的研究进展

端粒酶(Telomerase)是一种反转录酶,由RNA和蛋白质组成.对端粒酶的研究已成为一大研究热点,尤其是端粒酶与癌症及衰老的关系倍受科学家们的关注.就端粒酶的研究进展作一综述.     

Recognizing and Interpreting the Fossils of Early Eukaryotes

Using molecular sequence data, biologists cangenerate hypotheses of protistan phylogeny and divergence times. Fossils, however, provide our only direct constraints on the timingand environmental context of early eukaryotic diversification. Forthis reason, recognition of eukaryotic fossils in Proterozoic rocksis key to the integration of geological and comparative biologicalperspectives on protistan evolution. Microfossils preserved in shales of the ca. 1500 Ma Roper Group, northern Australia, display characters that ally them to the Eucarya, but, at present, attribution to any particular protistan clade is uncertain. Continuing research on wall ultrastructure and microchemistry promises new insights into the nature and systematic relationshipsof early eukaryotic fossils.     

RNA干扰及其在增强作物抵抗有害真核生物研究中的应用

RNAi是一种序列特异的同源依赖型基因沉默现象,在真核生物中普遍存在,是生物体抵抗核酸入侵、调控自身基因表达的重要途径。RNAi发现以后,很快就作为一种反向遗传学手段广泛应用于基因功能鉴定,并且在作物改良中得到了广泛应用,在作物抗病毒及品种改良方面得到了成功应用。近年来,随着对RNAi机制认识的不断加深,RNAi技术作为一种增强植物抵抗线虫、草食昆虫、真菌等有害真核生物的新策略的研究逐渐展开,并取得了一定成果,展现出良好的发展前景。对RNAi及其在增强植物抵抗有害真核生物方面的研究进展进行了综述,并对RNAi作为一种持久抗病虫育种策略的前景进行了展望。