根瘤菌分离纯化、回接工作的几点建议

根瘤菌分离纯化、回接工作的几点建议王素英（山西师范大学生物学系临汾０３１０００）根瘤菌的分离纯化及回接是进行根瘤菌形态、生理生化及遗传特性研究的基础。今介绍操作中的几点经验供参考。１根瘤消毒野外采集的根瘤是获得根瘤菌纯培养物的材料,根瘤消毒是进行分离...     

大豆根瘤菌对大豆愈伤组织侵染的观察

用光学显微镜和扫描电子显微镜明察了大豆根瘤菌1132—2对大豆子苗根愈伤组织的侵染。愈伤组织培养到第10—25d,接种根瘤菌再共同培养lO-30d光学显微镜观察发现：在愈伤组织疏松区域中有根瘤菌存在。扫描电镜观察发现：只有在细胞质较少的薄壁细胞之间和薄壁细胞内有根瘤菌存在,处在细胞间的根瘤菌许多处于分裂相,有的已经形成类菌体。     

根瘤菌结瘤基因研究的新突破

根瘤菌是能侵入合适寄主植物根部并形成根瘤的一类细菌。由于在根瘤中,根瘤菌可以大量固定大气中的氮,因而在生物固氮研究中具有重要地位。过去十年中,由于分子生物学技术的进展使我们对根瘤菌遗传的各个方面有了许多了解。在一些根瘤菌中,成功地识别、分离了与共生固氮有关的基因。这些基因中有一类是与根瘤菌固氮能力有关的,统称为固氮基因(Fix基因)其中偏码固氮酶的结构基因nif HDK在所有已检查过的固氮微生物中具     

基于非培养和培养的方法比较花生根瘤菌遗传多样性

摘要:【目的】比较非培养和培养方法揭示的花生根瘤菌遗传多样性差异,以期建立慢生根瘤菌快速检测占瘤率技术。【方法】采用经典分离培养技术获得花生根瘤菌和非培养方法直接从根瘤中收获类菌体分别提取DNA后,比较分析BOX-PCR指纹图谱,根据多样性指数评价基于非培养和培养方法的BOX-PCR指纹图谱技术揭示花生根瘤菌遗传多样性的差异。【结果】基于非培养方法检测的花生根瘤类菌体为81.8%,获得85种遗传群;基于培养方法分离花生根瘤菌菌株为72.7%,获得71种遗传群;两种方法共同检测到17种 BOX-PCR遗传图谱相一致。根据多样性指数基于非培养方法反映不同地区花生根瘤菌遗传多样性结果较一致,基于培养方法反映各地区的花生根瘤菌遗传多样性结果存在明显差异。【结论】基于非培养方法检测根瘤类菌体的遗传多样性,能够更快速、真实反映不同土壤花生根瘤中的优势遗传群,快速地统计根瘤菌菌株占瘤率;与培养方法相结合有利于获得花生根瘤菌竞争结瘤能力强的土著菌株,从而为筛选高效根瘤菌菌株奠定基础。     

根瘤菌与植物离体细胞培养物结合时的固氮活性

本文报道了根瘤菌和一些豆科及非豆科植物离体细胞培养物的结合固氮。豇豆型根瘤菌330、330 S 和32H1菌株与大豆(根、胚轴、子叶和叶子)细胞体外结合时均有固氮活性,与烟草叶片的细胞及马铃薯块茎的细胞体外结合时,固氮活性都比较高。在我们的试验中,豇豆型根瘤菌330和330 S 二个菌株的固氮活性都比32H1菌株的高。大豆根瘤菌(B_(15)、C_8和A_(84)菌株)与植物离体细胞结合时,固氮活性都不如豇豆型根瘤菌(330、330 S 和32H1)的高。不同种或品种的植物离体细胞培养物,对根瘤菌固氮活性有不同的影响。在我们的试验条件下,根瘤菌的固氮活性在注入乙炔1天后才开始出现,在一个月内随保温时间的延长,每瓶培养物中的乙炔还原成乙烯的量不断增高。但是,当以每克培养物的干重为单位时,在注入乙炔后5—10天内固氮活性增加较快,12天以后开始降低。根瘤菌在液体培养基中纯培养时,马铃薯的细胞悬浮液和马铃薯的提取汁都可以促进固氮酶活性的表达。     

沙打旺根瘤菌对紫云英的侵染结瘤性能

沙打旺(Astragalus adsurgensPall)和紫云英(Astragalus sinicusL.)皆属豆科黄芪属植物,都能与根瘤菌共生。但是,这两种寄主植物互换根瘤菌接种也能有效共生吗?这是根瘤菌研究中的一个新问题。在我国开始大面积飞机播种沙打旺后,我们曾想用紫云英根瘤菌接种沙打旺。但试验结果表明,紫云英根瘤     

根瘤菌分类的最新进展

一、传统的根瘤菌分类系统及存在的问题早期对豆科植物-根瘤菌共生的研究只涉及一些农业上重要的一年生种,很快就注意到了根瘤菌共生的“专一性”及相互接种的关系,即一个植物的分离物只与本属植物或少数其他属植物共生结瘤,反之亦然。以一个根瘤菌将一些植物联系起来成为一个族群,这     

银合欢和苏门答腊金合欢根瘤菌的分离和回接

从银合欢和苏门答腊金合欢的根瘤各分离出三个快生型的根瘤菌,对其形态作了初步的观察。这些根瘤菌可能是同一族的,它们对其寄主植物进行回接和互接均能引起银合欢和苏门答腊金合欢结根瘤,互接形成的根瘤形态与寄主植物的根瘤相同;箭舌豌豆和武宁苕子的根瘤菌不能引起银合欢和苏门答腊金合欢植株结根瘤;分离得到的根瘤菌对银合欢和苏门答腊金合欢均有反馈的增益作用,几个生物学指标均比对照的高;在无菌条件下,全氮培养抑制了根瘤菌对寄主植物结瘤,琼脂固体培养的植株根瘤固氮活性比沙培、水培的高。     

生物固氮与固氮菌质粒以及大质粒的分离(续)

五、质粒的检测和分离 1、大质粒的处理 采用通常使用于分离肠道细菌中质粒的“清亮裂解物(cleared lysate)法或类似方法从一些根瘤菌(Rhicobium)和兰细菌中获取到一些质粒。然而,它们的功能尚未查明,而且其分子量大都在70Md以下。目前已有可能分离到分子量超过300Md的质粒,而且除根瘤菌外,在固氮菌(Azotobacter)和拜叶林克氏菌(Beijerinckia)亦见到有质     

根瘤菌系统学研究进展与展望

根瘤菌(Rhizobia)原指能与豆科植物共生固氮的革兰氏阴性细菌,归属于变形杆菌门的α-变形杆菌纲和β-变形杆菌纲。近年来,细菌系统学研究方法的发展及大量新菌株的研究,大大改变了根瘤菌的分类方法和分类系统。最新的分类体系中,对α-纲内的根瘤菌属(Rhizobium)进行了重新划分:一部分种仍保留在根瘤菌属内,新增了副根瘤菌属(Pararhizobium)和新根瘤菌属(Neorhizobium),恢复并修订了土壤杆菌属(Agrobacterium)和其它根瘤菌属(Allorhizobium),且所有属中都包括了共生和非共生的细菌。α-纲内的中华根瘤菌属(Sinorhizobium)学名虽已被剑菌属(Ensifer)取代,但在研究共生的细菌时,前者的名称仍被广泛使用。在分类方法方面,最重要的进展是全基因组序列测定及平均核苷酸一致性(ANI)已取代传统的DNA同源性分析。由于16S rRNA基因序列在根瘤菌系统发育中的保守性,目前它多用于确定系统发育中属的分类地位,而多基因序列分析、全基因组序列比较来确定种的分类地位已成为确定根瘤菌基因种的"黄金标准"。加上生理生化特性、脂肪酸、醌等的快速测定获得表型和化学分类数据,使得近十年来根瘤菌的系统学快速发展。可以期待,未来基于全基因组序列分析的根瘤菌分类系统将更趋稳定,但大量的新种仍有待描述,而这仍会导致建立一些新属,或在原本不包括根瘤菌的细菌属内分离到一些共生固氮的种或菌株。另外,药用豆科植物苦参与含有不同结瘤基因型的多种根瘤菌共生混杂性的发现,突破了原来对共生专一性的认识,为豆科植物与根瘤菌之间共生关系的研究开拓了新思路。     

中国东北地区不同土壤类型中快生型大豆根瘤菌的生态分布与回接鉴定

我们从1982年开始分离中国东北地区不同土壤类型中的快生型大豆根瘤菌,由东北三省的黑土、白浆土、草甸土、盐土的64个样品中,分离得到大豆根瘤菌菌株46个,这些菌株中除传统的慢生型大豆根瘤菌外,还有在YMA培养基上生长速度快、世代时间短,在含溴麝香草酚兰(Bromothymol blue)的YMA培养基上产酸变黄的快生型大豆根瘤菌(Fast-growing Rhizobium japonicum)25株,现将其在东北地区不同土壤类型中的生态分布与回接鉴定的试验结果简报如下。     

四唑（Tetrazolium）对固氮鱼腥藻固氮和氢代谢的影响

固氮鱼腥藻(Anabaena azotica Ley)细胞能还原无色的TTC和NBT分别成为红色或蓝色的甲zan(formazan)沉淀。异形胞还原TTC的速率高于营养细胞。前异形胞及异形胞附近的营养细胞对NBT的还原作用最强。而异形胞对NBT不起还原作用。无论在异形胞形成红色甲zan或在营养细胞形成蓝色甲zan后都抑制固氮酶活性。NBT甲zan对固氮酶活性的抑制作用大于TTC甲zan,因为NBT氧化还原电位低于TTC。TTC和NBT两者都明显地抑制固氮鱼腥藻完整细胞的放氢。因鱼腥藻的放氢是由固氮酶催化的结果。四唑抑制放氢推想是由于它截取了固氮酶催化系统中的电子的缘故。固氮微生物(包括蓝色细菌和根瘤菌)对四唑还原与吸氢酶之间有无相关是一个争论的问题。一些学者认为分离豆科植物体的一些根瘤菌株培养于含有TTC的琼脂培养基,如还原,便可证明这些根瘤菌株能氧化氢;换言之,应用TTC的还原可作为一些根瘤菌的菌落具有吸氢酶的验证。相反,我们发现固氮鱼腥藻还原TTC和NBT之后,都没有影响吸氢的能力。因此,我们推想固氮鱼腥藻对四唑之还原与吸氢酶是没有直接的关系。     

根瘤菌的鞭毛染色

细菌的鞭毛极为纤细,必须用特殊的染色方法才能在普通光学显微镜下观察到。根瘤菌的鞭毛则更为纤细,染色更加困难。特别是根瘤菌的种类较多,同一个种的不同菌株生长速度相差很大,鞭毛出现的时间很不一致。因此,     

根瘤菌的自生固氮作用

由于根瘤菌与寄主--豆科植物有明显的依赖关系,而且有些科学家过去曾用选择培养基或加入植物提取物进行试验,企图证明根瘤菌的自生固氮能力没有获得成功,因此导致根瘤菌只有与高等植物共生时才能固氮的概念的形成。这可能由于当时检测方法不灵敏,以及没有找到根瘤菌自生固氮的合适条件。     

根瘤菌可溶性蛋白和酯酶的电泳图谱分析

我们分析行了二十株根瘤菌可溶性蛋白和酯酶的电泳图谱。菌株中14株分离自野大豆的快生型大豆根瘤菌和3株慢生型大豆根瘤菌;另外3株根瘤菌分别分离于苜蓿、豌豆和三叶草。根据它们电泳谱带的Rf值,计算了各根瘤菌可溶性蛋白图谱间的相似性系数。快生型大豆根瘤菌的电泳图谱均不同于慢生型大豆根瘤菌和其他根瘤菌。鉴于各菌株有其独特图谱,以此作为根瘤菌分类和鉴定的依据,是较可靠的方法。     

大豆根瘤菌蛭弧菌的发现*

从我国的一些大豆产区土壤中分离出四种大豆根瘤菌的噬菌蛭弧菌,对它们的培养特征、宿主范围以及其它生物学特性进行了初步研究,发现:大豆根瘤菌蛭弧菌具有典型的蛭弧菌特征,有极广泛的寄主范围和很强的裂解大豆根瘤菌的能力。它是影响结瘤效果和降低大豆产量的主要生物因子之一。     

水生藻状菌的研究方法

藻状菌纲(Phycomycetes)有200多属、1000多种,其体型与某些藻类很相似。水生藻状菌是指生活在水中或湿土中的属于藻状菌纲的一些低等真菌。由于它们的生活条件和生长发育与其它真菌有些不同,其研究方法也就有不同的地方。本文主要介绍它的采集、分离、培养、观察等方面的研究方法。     

苜蓿根瘤菌和羽扇豆根瘤菌的大质粒

根瘤菌在农业生产中有很重要的意义,但 由于其与豆科植物共生的复杂性,所以其遗传 学及固氮功能等重要课题的研究一直难以深 人。近几年来不少报道证明许多根瘤菌存在质 粒^[4,9,11-13]还有资料证明根瘤菌质粒带有共生 基因^[8,10]和至少一部分固氮基因^[2]。因此根瘤 菌质粒的研究在理论上和实践上都有重要意 义。迄今还未见国内有关根瘤菌质粒研究的报 道,本文将叙述我们筛选和分离根瘤菌质粒的 方法,并介绍得到的初步结果。     

四唑(Tetrazolium)对固氮鱼腥藻固氮和氢代谢的影响

固氮鱼腥藻(Anabaena azotica Ley)细胞能还原无色的TTC和NBT分别成为红色或蓝色的甲(月朁)(formazan)沉淀。异形胞还原TTC的速率高于营养细胞。前异形胞及异形胞附近的营养细胞对NBT的还原作用最强。而异形胞对NBT不起还原作用。无论在异形胞形成红色甲(月朁)或在营养细胞形成蓝色甲(月朁)后都抑制固氮酶活性。NBT甲(月朁)对固氮酶活性的抑制作用大于TTC甲(月朁),因为NBT氧化还原电位低于TTC。 TTC和NBT两者都明显地抑制固氮鱼腥藻完整细胞的放氢。因鱼腥藻的放氢是由固氮酶催化的结果。四唑抑制放氢推想是由于它截取了固氮酶催化系统中的电子的缘故。固氮微生物(包括蓝色细菌和根瘤菌)对四唑还原与吸氢酶之间有无相关是一个争论的问题。一些学者认为分离豆科植物体的一些根瘤菌株培养于含有TTC的琼脂培养基,如还原,便可证明这些根瘤菌株能氧化氢;换言之,应用TTC的还原可作为一些根瘤菌的菌落具有吸氢酶的验证。相反,我们发现固氮鱼腥藻还原TTC和NBT之后,都没有影响吸氢的能力。因此,我们推想固氮鱼腥藻对四唑之还原与吸氢酶是没有直接的关系。     

根瘤菌的生态研究——抗药菌株1035Strr在二种载体中的存活性(Ⅰ)

根瘤菌的存活性不仅是有关生态学问题,而且它对农业生产具有重要意义。从豆科植物分离得到的根瘤菌经过培养、吸附、贮存和接种植株后进入土壤,在其各阶段均涉及到根瘤菌的存活性。它是接种