地中海拟无枝菌酸菌U-32的3-氨基5-羟基苯甲酸合成酶(AHBAS)基因的克隆与序列分析

地中海拟无枝菌酸菌（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）Ｕ３２是一种临床上重要的抗生素———力复霉素ＳＶ的产生菌。研究表明,在地中海拟无枝菌酸菌的力复霉素生物合成过程中,３氨基５羟基苯甲酸合成酶（ＡＨＢＡＳ）是合成中间体Ｃ７Ｎ母核（又称ＡＨＢＡ）的关键酶。通过筛选以广宿主粘粒（Ｃｏｓｍｉｄ）ｐＬＡＦＲ３为载体构建的地中海拟无枝菌酸菌Ｕ３２的基因文库,获得６个阳性克隆子。将含有ＡＨＢＡＳ基因的约２５ｋｂ的片段克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ和ＫＳ上,进行酶谱分析得到其在染色体上的初步定位。序列测定表明地中海拟无枝菌酸菌Ｕ３２中的ＡＨＢＡ合成酶基因,由１１６７ｂｐ组成,起始密码子为ＡＴＧ,终止密码子为ＴＧＡ,共编码３８８个氨基酸,所克隆到的ＡＨＢＡ合成酶基因在大肠杆菌的启动子控制下获得诱导表达,蛋白分子量约为４３ｋＤ。     

地中海拟无枝菌酸菌U32中amrC／amkC基因的序列分析及在大肠杆 …

从力复霉素ＳＶ产生菌－－地中海拟无枝菌酸菌（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）Ｕ３２的硝酸盐同化基因簇的上游克隆了一个２．６ｋｂ的ＥｃｏＲＩ－ＸｈｏＩ ＤＮＡ片段并测定其序列。序列分析表明,该ＤＮＡ片段编码两个完整的开放阅读框架（ＯＲＦ）,ＯＲＦ２的起始密码子ＧＴＧ与ＯＲＦ１的终止密码子ＴＧＡ在ＴＧ处重叠。ＯＲＦ１编码一个含２２４个氨基酸的多肽,它同放线菌中典型的应答调节蛋白包     

地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediteranei)U-32硝酸还原酶的定位、纯化及性质

在力复霉素ＳＶ研究中,发现硝酸盐对抗生素合成呈现多效性作用,不仅大幅度提高产量,还对产生菌——地中海拟无枝菌酸菌生理产生多方面的影响,从而提出整体性调节的结论．这一多效性作用是由硝酸盐所引起的,为此对硝酸还原酶进行了研究．首先,通过原生质体渗透裂解发现地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２的硝酸还原酶是一个胞质酶．该酶极不稳定,缓冲液中加入硝酸钾、甘油等保护剂能极大地提高其稳定性．通过硫酸鱼精蛋白沉淀,硫酸铵分级分离,Ｐｈｅｎｙｌ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ、Ｂｉｏ－ＧｅｌＡ１．５ｍＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析等多步纯化得到了电泳纯的硝酸还原酶．该酶为一７９ｋＤ的单亚基酶,每分子酶含有约２．２９原子的钼,但并不含有非血红素铁、酸不稳定硫、ＦＭＮ及ＦＡＤ,其等电点为６．２,反应最适ｐＨ为７．２,最适温度为４０℃．对硝酸根的Ｋｍ值为１３．３μｍｏｌ／Ｌ．同时分析了该酶的吸收光谱．     

地中海拟无枝菌酸菌专一的噬菌体φMMR1的研究

从生产力复霉素ＳＶ的地中海拟无枝菌酸菌（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）Ｕ１１９的工业发酵罐裂解液中,分离到一株新的噬菌体φＭＭＲ。该噬菌体经多次单斑分离、纯化,得到的噬斑多数为清亮的（约占９０％）,其它噬斑为浑浊斑,但未能从中分离到溶源菌。在被测试的可能的宿主菌中,φＭＭＲ１不能感染除地中海拟无枝菌酸菌以外的菌株,说明寄主范围很窄。对φＭＭＲ１的增殖和储存条件,诸如ｐＨ值、温度、二价金属离子、有机溶剂等对φＭＭＲ１的影响进行了较详细的研究。电子显微镜观察揭示,φＭＭＲ１为长尾无收缩尾鞘,头为正多面体,属长尾噬菌体科Ｂ１亚群。制备了φＭＭＲ１的兔抗血清,并测定了φＭＭＲ１以地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２为宿主菌的一步生长曲线。使用２４种限制性内切酶对φＭＭＲ１ＤＮＡ进行了单酶切分析。结果表明,φＭＭＲ１基因组ＤＮＡ为线状双链,未找到粘性末端,大小约为５９６ｋｂ。φＭＭＲ１ＤＮＡ的Ｇ＋Ｃ含量为６７％。利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析了噬菌体的外壳蛋白多肽的组成。纯化的裸露噬菌体ＤＮＡ可利用电穿孔技术成功地转染地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２。     

利用同源重组建立地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的基因置换/中断系统

地中海拟无枝菌酸菌U32是力复霉素SV的工业产生菌,其遗传操作一直是一个难题。在该菌株DNA高效电转化的基础上,利用同源重组的原理,建立了地中海拟无枝菌酸菌染色体的基因置换/中断系统。通过大肠杆菌重组质粒pDK110构建、转化及两步重组筛选,成功地用α淀粉酶基因（amy）取代了地中海拟无枝菌酸菌U32染色体上的3-氨基-5-羟基苯甲酸合成酶基因（ahbas）。第一步单交换和第二步双交换的频率分别是0.5%～0.7% 和 2%。将质粒pDK110变性后转化可显著提高重组频率,在第二步筛选双交换前对单交换重组子进行电击也能够提高其双交换重组的频率。此外,通过转化构建的两端带同源区段的线性DNA片段及一步重组筛选,我们在地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的amrD,rifO基因中间插入了阿普拉霉素抗性基因（apr）,其效率约为30～50转化子/μgDNA。     

构建基因工程菌发酵产生维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸

从棒状杆菌ＳＣＢ３０５８克隆得到两个２,５－ＤＫＧ＾＊＊还原酶基因后,构建了两个能够表达２,５－ＤＫＧ还原酶的基因工程大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＥＴ９ａⅡ和ＤＨ５α（ｐＢＬ４）和一个基因工程欧文氏菌ＥＲ９７。２,５－ＤＫＧ还原酶基因分别受控于ＰＬ或Ｔ７启动子,通过加入ＩＰＴＧ或提高温度进行诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和酶活测定确定它们在诱导后得到了高表达,用细胞抽提液在加入辅酶ＮＡＤＰＨ的体外实验中转     

地中海拟无枝菌酸菌专一的噬菌体ψMMR1的研究

从生产力复霉素ＳＶ的地中海拟无枝菌酸菌Ｕ１１９的工业发酵罐裂解液中,分离到一株新的噬菌体ψＭＭＲ。该噬菌体经多次单斑分离、纯化,得到的噬斑多数为清亮的（约占９０％）,其它噬斑为浑浊斑,但未能从中分离到溶源菌。在被测试的可能的宿主菌中,ψＭＭＲ１不能感染除地中海拟无枝菌酸菌以外的菌株,说明寄生范围很窄。对ψＭＭＲ１的增殖和储存条件,诸如ｐＨ值、温度、二价金属离子、有机溶剂等对ψＭＭＲ１的影响进行了较     

利福霉素生产菌产生钝化RifSV物质的分离及性质研究

利福霉素ＳＶ（简称ＲｉｆＳＶ）生产菌──地中海拟无枝菌酸菌在生物合成ＲｉｆＳＶ过程中,产生一种能钝化自身产物（ＲｉｆＳＶ）的物质．实验证实,该物质是由谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸及缬氨酸等１４种常见氨基酸组成的蛋白质．分子量（ＭＷ）约２．５×１０４Ｄ,等电点（ＰＩ）为５．７—６．１．在１００℃下加热１０ｍｉｎ,其活性丧失．作用于ＲｉｆＳＶ的最适ｐＨ值范围为７．４—８．６,最适温度为２９℃,初步证实该物质是一种酶（暂称利福霉素钝化酶）     

尿激酶抗人交联纤维蛋白—D—二聚体单抗化学偶合体的制备

利用双功能试剂Ｎ－琥珀酰亚胺－３（２－二硫吡啶）丙酸酯（ＳＰＤＰ）作交联剂,合成了尿激酶（ＵＫ）－抗人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体单抗（ＭＡ－ＨＩＤ１）化学偶合体（ＵＫ．ＭＡ－ＨＩＤ１）并用苯甲脒－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ及人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱纯化,获得偶合体产物,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ呈现一条带,其分子量约为２０００００,纤维蛋白平板法测活结果显示,偶合体中酶比活     

高产稳产聚羟基烷酸的重组大肠杆菌的构建

重组大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ） 含有携带聚羟基烷酸（ＰＨＡ） 合成基因（ ｐｈａＣＡＢ）＊＊ 的质粒ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ,是很有潜力的ＰＨＡ 生产菌,但存在着质粒不稳定和不能合成３羟基丁酸（３ＨＢ） 与３羟基戊酸（３ＨＶ） 共聚物［Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ）］ 的缺陷。将ＲＫ２ 质粒上的ｐａｒ ＤＥ 基因引入ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ 构成质粒ｐＪＭＣ２ ,该质粒可以在宿主Ｅ．ＣｏｌｉＨＭＳ１７４ 中稳定遗传。将培养基中的磷酸盐浓度降至１８ ｍ ｍｏｌ／Ｌ,发现Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ｐＪＭＣ２） 能够以丙酸为前体合成Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ） ,其中３ＨＶ 在共聚物中的含量为５ ％ ～８ ％ 。在５Ｌ自动发酵罐中分批补料培养Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ｐＪＭＣ２） ,培养基初始磷酸盐浓度为１５ ｍ ｍｏｌ／Ｌ,３０ ｈ 后每升培养液中干菌体可达４２－５ ｇ,Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ） 占干重的７０ ％ ,其中３ＨＶ 在共聚物中的含量为４－９ ％ 。     

L－异亮氨酸产生菌选育的研究

以黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７为出发菌株,经硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、紫外线（ＵＶ）和亚硝基胍（ＮＴＧ）逐级诱变处理,α－氨基－β－羟基戊酸（ＡＨＶ）、Ｓ－２－氨基乙基－Ｌ－半胱氨酸（ＡＥＣ）、磺胺胍（ＳＧ）、乙硫氨酸（Ｅｔｈ）、α－氨基丁酸（α－ＡＢ）、异亮氨酸氧肟酸（ＩｌｅＨｘ）等氨基酸结构类似物及琥珀酸为碳源平板定向筛选,获得一株Ｌ－异亮氨酸高产菌ＺＱ－４（ＡＨＶ~γ、ＡＥＣ~γ、ＳＡＭ~γ、ＳＧ~γ、Ｅｔｈ~γ、α－ＡＢ~γ、ＩｌｅＨｘ~γ）在含１３．５％葡萄糖培养基中,摇瓶发酵７２ｈ、Ｌ－异亮氨酸积累可达２．８－３．０％。     

L－异亮氨酸产生菌选育的研究

以黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７为出发菌株,经硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、紫外线（ＵＶ）和亚硝基胍（ＮＴＧ）逐级诱变处理,α－氨基－β－羟基戊酸（ＡＨＶ）、Ｓ－２－氨基乙基－Ｌ－半胱氨酸（ＡＥＣ）、磺胺胍（ＳＧ）、乙硫氨酸（Ｅｔｈ）、α－氨基丁酸（α－ＡＢ）、异亮氨酸氧肟酸（ＩｌｅＨｘ）等氨基酸结构类似物及琥珀酸为碳源平板定向筛选,获得一株Ｌ－异亮氨酸高产菌ＺＱ－４（ＡＨＶ~γ、ＡＥＣ~γ、ＳＡＭ~γ、ＳＧ~γ、Ｅｔｈ~γ、α－ＡＢ~γ、ＩｌｅＨｘ~γ）在含１３．５％葡萄糖培养基中,摇瓶发酵７２ｈ、Ｌ－异亮氨酸积累可达２．８－３．０％。     

力复霉素产生菌地中海拟无枝菌酸菌U32丙氨酸脱氢酶基因克隆及表达

丙氨酸脱氢酶(EC1411)可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸和NADH。它是生物体内的氨基酸代谢和氨同化途径的关键酶。在地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32中,丙氨酸脱氢酶的活力与力复霉素的生物合成有负相关现象,其活力受KNO3全局效应的调控。根据结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)的丙氨酸脱氢酶氨基酸的保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好,设计一对简并PCR引物。以此引物从地中海拟无枝菌酸菌U32中扩增到一555bp的片段,并以此片段为探针从地中海拟无枝菌酸菌U32 基因组cosmid文库中成功的克隆到了丙氨酸脱氢酶结构基因(ald)。它编码了一个371个氨基酸的蛋白质,基因的GC含量为72.5％,符合链霉菌的基因结构特征。在起始密码子的上游6个碱基处,有一典型的链霉菌核糖体结合位点(RBS)：AGGAGG,第75位的氨基酸为赖氨酸,是丙酮酸结合位点。以pET28b为载体,在E.coli BL21(DE3)中高效表达了ald基因。用IPTG在22℃时诱导得到的丙氨酸脱氢酶活力最高。用HisTag柱纯化了表达的丙氨酸脱氢酶。酶学性质研究表明该酶专一性以LAla和NAD(H)为底物。     

浣熊痘病毒TK基因对5—BUdR药物不敏感性的研究

本文在Ｒａｔ－２（ＴＫ）细胞上，对浣熊痘病毒ＴＫ基因作为病毒筛选 标记的作用进行了研究。发现浣熊痘病毒虽然具有ＴＫ基因的序列和功能，但对５－溴脱氧尿嘧啶（５－ＢＵｄＲ）药物的选择压力并不敏感。即使采用ＨＡＴ培养基挑选的单斑病毒对３－ＢＵｄＲ也具有抵抗力。     

地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶的基因克隆

outhern杂交分析表明在地中海拟无枝菌酸菌u－32染色体DNA和黑曲霉niaD(硝酸还原酶基因)之间存在着明显的同源性。利用异源niaD探针从地中海拟无枝菌酸菌u－32基因文库中筛选得到一个能与niaD杂交的5.0kb的Pst Ⅰ片段。该片段经同位素标记后能与地中海拟无枝菌酸菌u－32染色体上一个相同的Pst Ⅰ片段杂交,位于这一片段上的2．1kb sma Ⅰ—EcoR Ⅴ片段只能与以硝酸盐为唯一氮源的总RNA杂交,而不能与相同条件下以铵盐为唯一氮源的总RNA杂交,这些结果表明,所克隆到的5,0kb Pst Ⅰ DNA片段含有地中海拟无枝菌酸菌U-3z的硝酸还原酶基因。这是好氧细菌硝酸还原酶基因克隆的首次报道。由该酶蛋白分子量推测,其结构基因大小在1．5kb左右,进一步的杂交分析发现在5．0kb的Pstl片段中含有完整的NR基因。用20种限制酶对重组质粒pJLl进行了限制酶酶谱的构建。发现有10种酶在pJLl外源片段上无切点,6种酶为单切点,EcoR Ⅰ与Sma Ⅰ各有两个切点。     

欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列,利用ＰＣＲ技术,从克隆质粒和欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＣＢ１２５染色体中重新扩增得到含有２－酮基醛糖还原酶Ａ和Ｂ（２－ＫＲＡ和Ｂ）基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体ｐＢＬ并转化大肠杆菌ＢＨ５α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到ｔｋｒＡ内部使其突变失活     

棒状杆菌2,5—二酮基—D—葡萄糖酸还原酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的克隆？…

从棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＳＣＢ３０５８）初步纯化得到两个２,５－二酮基－Ｄ－葡萄糖酸（２,５－ＤＫＧ）还原酶,在此基础上利用ＰＣＲ技术,以基因组ＤＮＡ为模板,扩增得到含有２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到ＰＧＥＭ３Ｚｆ（＋并转化大肠杆菌ＤＨ５α,是到阳性克隆ｐＧＥＭ８１３。     

高分子量和低分子量尿激酶的分离纯化及动力学性质研究

人尿激酶粗品经苯甲脒亲和柱纯化和Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＰａｋＳＰ柱分离后,得到两种分子量的尿激酶（ＵＫ）,即高分子量尿激酶（ＨＵＫ）和低分子量尿激酶（ＬＵＫ）,采用民斯亮蓝法测定蛋白质浓度,纤维蛋白板法测定活力,测得ＨＵＫ比活为２．９×１０＾５ＩＵ／ｍｇ蛋白,ＬＵＫ为３．５１０＾５ＩＵ／ｍｇ蛋白,活力回收为７０％以上,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,ＨＵＫ和ＬＵＫ均呈单一条带,分子量分别为５４ｋＤ和３３ｋＤ,Ｈ     

宫粉郁金的组织培养和快速繁殖

１植物名称宫粉郁金（Ｃｕｒｃｕｍａ　ｋｗａｎｇｓｉｅｎｓｉｓ）。２材料类别　块茎萌动芽。３培养条件　萌动芽生长培养基：（１）ＭＳ＋６－ＢＡ１ｍｇ·Ｌ－１（单位下同）＋ＮＡＡ０．２。不定芽增殖与愈伤组织诱导培养基：（２）ＭＳ＋６－ＢＡ１０＋ＫＴ５;（３）ＭＳ＋６．ＢＡ１０;（４）ＭＳ＋６－ＢＡ５＋ＫＴ２．５;（５）ＭＳ＋６－ＢＡ５;（６）ＭＳ＋６－ＢＡ２＋ＫＴ１。生根培养基：（７）ＭＳ＋ＮＡＡ０．５;（８）ＭＳ＋６－ＢＡ０．５＋ＮＡＡ０．５;（９）ＭＳ。以上培养基均加０．７％琼脂,３％蔗糖,ｐＨ５…