棒状杆菌2,5—二酮基—D—葡萄糖酸还原酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的克隆？…

从棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＳＣＢ３０５８）初步纯化得到两个２,５－二酮基－Ｄ－葡萄糖酸（２,５－ＤＫＧ）还原酶,在此基础上利用ＰＣＲ技术,以基因组ＤＮＡ为模板,扩增得到含有２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到ＰＧＥＭ３Ｚｆ（＋并转化大肠杆菌ＤＨ５α,是到阳性克隆ｐＧＥＭ８１３。     

棒状杆菌2，5-DKG还原酶基因在欧文氏菌中的表达

将能够在大肠杆菌内高效表达棒状杆菌2,5-DKG还原酶I基因的质粒pBL4改造成为具有链霉素抗性的质粒pBLS,采用改进的感受态转化法将pBLS导入能够利用葡萄糖高产2,5-DKG的欧文氏菌SCB125中,通过提高温度诱导,经SDS-PAGE分析2,5-DKG还原酶I获得了高效表达,占菌体总蛋白的22%,不形成包涵体。体外酶活测定结果表明表达的酶具有较高的活力。同时,通过凝胶活力染色发现了宿主欧文氏菌SCB125中存在一个活力较强的2-酮基醛糖还原酶。     

棒状杆菌2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的克隆与表达

从棒状杆菌(Corynebacterium sp.SCB3058)初步纯化得到两个2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5 DKG)还原酶,在此基础上利用PCR技术,以基因组DNA为模板,扩增得到含有2,5-DKG还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到PGEM3Zf(+)并转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆pGEM813.序列分析表明,片段全长1107bp,含有一个834bp的开放阅读框架,编码产生由278个氨基酸组成的分子量为34kD的蛋白.将目的基因的调控序列进行缺失突变后,克隆到原核表达载体pBL上获得表达质粒pBL4.通过温度诱导,经SDS-PAGE分析有明显的表达条带,约占菌体总蛋白的20%,并且表达的蛋白具有较高的酶活力.构建的优良基因工程菌为最终实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体2-酮基-L-古龙酸打下了基础.     

欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列,利用PCR技术,从克隆质粒和欧文氏菌(Erwinia sp.)SCB125染色体中重新扩增得到含有2酮基醛糖还原酶A和B(2KRA和B)基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体pBL并转化大肠杆菌DH5α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到tkrA内部使其突变失活并作为阳性筛选标记,再将此突变基因构建到分配不稳定型质粒pBR322上,导入宿主菌后与染色体上正常基因进行同源重组交换,筛选质粒丢失的阳性菌落进行进一步鉴定。这项工作将为阻断旁路代谢,实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体2酮基古龙酸(2KLG)打下基础。     

欧文氏菌和棒杆菌的属间隔合研究

研究了用原生质体融合技术获得欧文氏菌和棒杆菌的融合细胞,串联发酵Ｄ－葡萄糖产生２－酮基－Ｌ－古龙酸的第一步发酵菌株欧文氏菌ＳＣＢ２４７经０．８ｍｇ／ｍＬ溶菌酶酶解０．５ｈ后,原生质体的形成率和再生率分别为９９．８％和２７．８％。第二步发酵菌株棒杆菌ＳＣＢ３０５８经预处理后由１．３ｍｇ／ｍＬ溶菌酶酶解２ｈ,原生质体的形成率和再生率分别为９９．５％和５６．３％,用携带氨苄青霉素抗性标记的ＳＣＢ２４７和     

欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列,利用ＰＣＲ技术,从克隆质粒和欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＣＢ１２５染色体中重新扩增得到含有２－酮基醛糖还原酶Ａ和Ｂ（２－ＫＲＡ和Ｂ）基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体ｐＢＬ并转化大肠杆菌ＢＨ５α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到ｔｋｒＡ内部使其突变失活     

真养产碱杆菌聚羟基烷酸合成酶基因在欧文氏菌中的表达

将含有真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)合成聚羟基烷酸(PHA)基因(phaCA3)的质粒pTZl8U—PHB改造成为具有卡那霉素抗性的质粒pJMCl．并以电击法将pJMCl引入利用碳源广泛的胡罗卜软腐欧文氏茵(Erwinia carotovora)非致病菌系(Eccl3B)中,phaCAB可获得高效表达,膨大的转基因菌[Eccl3B(pJMCl)]细胞内几乎充满PHA颗粒。以蔗糖为碳源,初步在5L发酵罐中对转基因菌进行分批补料培养35h,菌体干重达28g／L,PHA占菌体干重的68％,具有生产潜力。将该菌合成的PHA提取纯化(纯度达99％)后,进行核磁共振分析,发现它只有单一的聚-β-羟基丁酸(PHB)组分。     

芽孢杆菌和欧文氏菌的原生质体融合的研究

采用原生质体融合技术对带有链霉素标记的芽孢杆菌B12 13 2 和带有红霉素标记的欧文氏菌E2 6 2 3 进行原生质体融合。采用选择性及非选择性培养基对融合子进行 10次重复性传代试验后 ,获得稳定的融合子 2 84株 ,经重复性苎麻脱胶试验 ,从中获得 6株脱胶效果较好的融合子。     

腋毛杆菌与微小棒状杆菌和微小诺卡氏菌的鉴别研究

本文报告腋毛癣病原菌在我国首次分离成功。从487例腋毛癣患者病毛中检出病原菌489株,检出率为38.8%。从形态学、生长条件、生化反应、免疫试验和菌体成份等方面,将该菌与微小棒状杆菌和微小诺卡氏菌进行了鉴别研究。三种细菌有明显差别,将腋毛癣病原菌暂命名为腋毛杆菌。目前,国际上对腋毛癣(感染)的病原菌报道不一致,较多学者认为是微小棒状杆菌或微小诺卡氏菌。我们根据初步的研究认为,我国南方人所感染的腋毛杆菌不属于这两种菌,而是另一种。现将研究结果报道如下。     

库特氏棒状杆菌败血症1例报告

库特氏棒状杆菌败血症１例报告云南省玉溪地区医院，云南省医学微生态研究中心６５３１００陈宗淦，鲁慎文，朱江，刘姝惠云南省玉溪地区卫校史云丽我们从１例发热、贫血患者骨髓和血液中均分离出库特氏棒状杆菌，现报告如下。１．临床资料患者，女，５２岁，回族，工人，...     

欧文氏菌噬菌体的分离纯化及生物学特性研究

以欧文氏菌胡萝卜亚种为宿主菌,从环境污泥中分离到10株噬菌体.噬菌体热稳定性、pH稳定性分析结果表明噬菌体Erj2、Erb1、Erc2在温度-20～40℃、pH4.0～9.0之间均表现出良好的稳定性.噬菌体生物学特性分析显示,它们的最佳感染复数分别为0.0001、0.001、0.0001;核酸类型均为双链DNA;一步生...     

2,5-DKG还原酶Ⅰ的分离纯化与性质研究

欧文氏菌ER97高效表达了从棒状杆菌SCB3058克隆的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（2,5-DKG）还原酶Ⅰ基因,5L罐发酵后,收集菌体破碎,将胞内可溶性的蛋白通过硫酸铵分级沉淀、DEAE—Sepharose CL-6B离子交换柱层析和Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱层析后分离纯化到了2,5-DKG还原酶Ⅰ,纯化了5倍,得率27％,比活力为3,418U／mg。测定了该酶的一些特性参数：分子量为34kD,等电点为6．0,它以NADPH为辅酶,将2,5-DKG还原为2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）,对NADPH和2,5-DKG底物的Km值分别是0．29mmol／L和14．7mmol／L,1mmol／L Cu^2＋、Zn^2＋等有强烈抑制作用,EDTA和巯基乙醇对该酶没有抑制作用,酶的最适pH为7．0,最适反应温度为40℃。     

菌体脂多糖在大白菜软腐欧文氏菌对寄主根表吸附中的作用

用两种方法分别洗除菌体胞外多糖(EPS)和脂多糖(LPS),经在大白菜幼苗上测定表明,菌体洗除LPS后对寄主根表的吸附能力明显减弱,吸附菌量随无LPS的菌体在混合接种体中比例的增高而降低,在无LPS的菌体接种体中加入LPS提取物,可使吸附能力恢复到正常水平;平行测定的EPS不发生上述影响。用EPS和LPS对根表进行预处理,均可明显抑制完整菌体(不洗,含EPS和LPS)和无EPS的菌体对根表的吸附,但只有LPS预处理使无LPS的菌体吸附量提高2—3倍。用大白菜对该菌的专化性细菌凝集素Agin—SD60所作的菌体凝集试验表明,菌体洗除LPS后不再被 Agin—SD60所凝集。根据以上结果认为,菌体脂多糖在大白菜软腐欧文氏菌与寄主的接触识别中可作为细菌识别子起作用。     

2,5-DKG还原酶I的分离纯化与性质研究

欧文氏菌ER97高效表达了从棒状杆菌SCB3058克隆的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)还原酶I基因,5 L罐发酵后,收集菌体破碎,将胞内可溶性的蛋白通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析和Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱层析后分离纯化到了2,5-DKG还原酶I,纯化了5倍,得率27%,比活力为3,418 U/mg。测定了该酶的一些特性参数:分子量为34 kD,等电点为6.0,它以NADPH为辅酶,将2,5-DKG还原为2-酮基-L-古龙酸(2-KLG),对NADPH和2,5-DKG底物的Km值分别是0.29mmol/L和14.7 mmol/L,1 mmol/L Cu2 、Zn2 等有强烈抑制作用,EDTA和巯基乙醇对该酶没有抑制作用,酶的最适pH为7.0,最适反应温度为40℃。     

欧文氏菌和棒杆菌的属间融合研究*

研究了用原生质体融合技术获得欧文氏菌和棒杆菌的融合细胞。串联发酵Ｄ－葡萄糖产生２－酮基－Ｌ－古龙酸的第一步发酵菌株欧文氏菌ＳＣＢ２４７经０．８ｍｇ／ｍＬ溶菌酶酶解０．５ｈ后,原生质体的形成率和再生率分别为９９．８％和２７．８％。第二步发酵菌株棒杆菌ＳＣＢ３０５８经预处理后由１．３ｍｇ／ｍＬ溶菌酶酶解２ｈ,原生质体的形成率和再生率分别为９９．５％和５６．３％。用携带氨苄青霉素抗性标记的ＳＣＢ２４７和经热灭活的ＳＣＢ３０５８为亲本,在４０％ＰＥＧ６０００和０．２ｍｏｌ／Ｌ新生磷酸钙等适宜条件下融合,融合频率为３．６×１０~(－６)。在非选择和选择培养基上连续传代十几次后,对融合子的单菌形态、染色结果、菌落形态、色泽、总蛋白量、同工酶、发酵性能等方面与亲本进行了比较。结果表明,融合子确系棒杆菌和欧文氏菌的融合细胞。摇瓶发酵结果显示,所得的３８株稳定的融合子中约４０％能转化葡萄糖为维生素Ｃ前体２－酮基－Ｌ－古龙酸。     

2,5—KDG还原菌Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的２,５－二基－Ｄ－葡萄糖酸还原酶Ⅱ基因序列,合成两个引物序列并在两端加上ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ两个酶切位点,抽提棒状杆菌ＳＣＢ３０５８菌株的染色体灯反进行ＰＣＲ反应,克 得到２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅱ基因,酶切验民预期的结果相符合。将此片段克隆到ＰＧＥＭ－Ｔ载体上保存将２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅱ基因用ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨＩｍ内切酶切下,连接到ＰＢＶ２２０载体上,构建成表达载体,４２℃诱导不能得     

沼泽红假单胞菌偶氮还原酶新基因的克隆表达

前期实验证明沼泽红假单胞菌（Rhodopsedomonas palustris）对偶氮染料有较强的隆解能力,通过PCR扩增,从该菌粒DNA中扩增获得了一条未登录新基因PAR-1。将该基因构建到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1,通过IPTG诱导,进行原核蛋白表达,SDS-PAGE电泳显示,有约48kD融合蛋白表达。对经诱导的大肠杆菌（BL21）进行偶氮染料脱色试验,检测到轻微脱色活性。