转双基因烟草对棉铃虫的杀虫活性评价*

以含Bt杀虫蛋白基因(单基因)烟草和常规烟草为对照,系统测定了含Bt与豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)蛋白基因(双基因)的抗虫烟草对棉铃虫(Helicoverpa armigera)不同龄期幼虫的杀虫活性.结果表明：1～3龄幼虫取食转双基因烟草3d后死亡率为80.5%～99.3%,取食6d后死亡率达100%,均显著高于转单基因烟草。2龄幼虫取食转基因烟草3d后转至正常饲料,转双基因烟草对幼虫死亡率、存活虫体重、化蛹率和化蛹时间等生长发育的影响,均显著高于转单基因烟草。     

转双基因抗虫棉对棉铃虫的抗性

将苏云金杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ,Ｂｔ)杀虫晶体蛋白 (ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｃｒｙｓｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ ,ＩＣＰ)基因转入棉花植株中获得的抗虫棉花 (下略为Ｂｔ棉 ) ,为棉花害虫综合防治开辟了新的途径。Ｂｔ棉除具有丰产性、纤维品质好和对靶标害虫的良好控制作用等特性外 ,更重要的应用价值在于其高杀虫效果与维护生态环境的协调发展的良性作用上[1] 。但研究结果已表明 ,害虫对ＢｔＩＣＰ的抗性适应 ,将严重威胁Ｂｔ棉的使用寿命[2 ] 。已有的报道证明 ,将两种不同作用机制的杀虫基因转入植物并同时表…     

获得高抗虫转双基因烟草

利用DNA合成仪人工合成了豇豆胰蛋白酶抑制剂(cpTl)的cDNA编码全序列。合成的基因经过克隆和序列分析后．克隆到植物高效表达载体上,并转化农杆菌,通过共转化的方法,将cpTI基因和经人工改造的苏云金芽孢杆菌(B．T)δ－内毒素基因共转化烟草,得到经PCR扩增并Southern－blotting验证的分别含有CpTI和B．T基因的植株以及同时含有CpTI和B．T基因的植株。利用棉铃虫幼虫进行的杀虫测试表明．转基因烟草和对照烟草相比具有明显的杀虫活性-同时转双基因的烟草和转单一基因的烟草相比具有增强的杀虫活性。     

新疆棉区转Bt基因棉对棉铃虫生物学的影响

棉铃虫Helicoverpaarmigera高龄幼虫取食转Bt基因棉花组织后 ,化蛹率、羽化率、蛹重、体长均有显著下降 ,在转Bt基因棉花上棉铃虫的取食行为也受到较大的影响 ,表现为取食次数明显减少、吐丝下垂次数明显增加 ;无论是转Bt基因棉花还是常规棉花 ,棉铃虫 3龄幼虫主要分布于繁殖器官上 ,在转Bt基因棉花各繁殖器官上的分布概率为 :花 >棉铃 >棉蕾 ,常规棉花上分布概率为 :棉蕾 >棉铃 >花 ;棉铃虫高龄幼虫取食转Bt基因棉花各组织 ,成虫羽化后产卵量、卵孵化率均有明显下降 ;在较低的棉铃虫虫口密度下 ,转Bt基因棉花对棉铃虫有一定的产卵排趋性。     

转人工合成GFM CryIA基因烟草表现明显杀虫活性

为了使来自原核生物的苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白（ＩＣＰ）基因能够在高等植物中得到很好的表达,对编码这种杀虫晶体蛋白基因的核苷酸顺序进行了必要而又合理的修饰和改造：不改变杀虫晶体蛋白基因的氨基酸编码顺序,将杀虫晶体蛋白基因的密码子更换成植物基因组中常用的优化密码子,同时更换掉Ｂｔ杀虫晶体蛋白结构基因中的不稳定元件,人工全合成了长度为１８２４ｂｐ的杀虫晶体蛋白基因－ＧＦＭ ＣｒｙＩＡ基因。为了检测合     

转Bt基因棉花对棉铃虫不同龄期幼虫的杀虫活性和抑制生长作用

以我国培育的转Bt基因棉花(简称Bt棉)为材料,系统测定了Bt棉叶片对棉铃虫 Helicoverpa armigera(Hubner)不同龄期幼虫的杀虫活性和抑制生长的作用。结果表明,Bt棉的杀虫活性随着龄期的增大而趋于降低,其中处理3d只对1龄幼虫有较高效果;从1～4龄开始连续取食Bt棉后均不能化蛹,5龄幼虫则能正常化蛹。3龄幼虫取食Bt棉叶3d后的体重与初始体重之比为0.94,而取食常规棉叶的相应比值为5.48,对幼虫生长的抑制作用明显。在28℃条件下用Bt棉饲养棉铃虫1～3龄幼虫3d,对幼虫的致死率显著高于25℃处理,对3龄幼虫抑制生长的作用也显著提高。研究结果可为确定棉铃虫对Bt棉的抗性监测与治理技术以及Bt棉的田间应用技术提供依据。     

Bt杀虫晶体蛋白基因及其转因育种研究进展

本文简要介绍了Ｂｔ杀虫晶体蛋白及其编码基因,以及目前通过基因工程方法获提地转Ｂｔ杀虫晶体蛋白基因植物,着重分析和探讨了目前转Ｂｔ杀虫晶体蛋白奇才志基因植物及转基因中存在的一些问题,并就这些问题及合理持续利用Ｂｔ杀虫晶体蛋白提出了一些见解。     

棉铃虫对转Bt基因棉花的行为反应

棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是转Bt基因棉花(Bt棉)最重要的靶标害虫之一。害虫对Bt棉的抗性问题是Bt棉产业持续健康发展的最主要威胁。规避行为可以减少害虫与Bt棉的接触而降低生理抗性选择压力。在本研究中,通过比较棉铃虫对Bt棉与常规棉的行为反应评估了棉铃虫对Bt棉的行为规避能力。产卵选择结果显示,棉铃虫成虫在Bt棉上的落卵量显著低于常规棉。幼虫实验结果显示,棉铃虫初孵幼虫在Bt棉植株上的居留时间显著短于在常规棉上的居留时间。无选择条件下,1龄幼虫在对Bt棉叶的取食空洞数以及总取食量均显著低于常规棉叶。综合以上的结果,认为棉铃虫对Bt棉具有一定的行为规避能力,这可能是延缓棉铃虫对Bt棉产生抗性的因素之一。本研究能够帮助有效地预测靶标害虫对Bt作物的抗性风险。     

棉铃虫对Bt生物农药早期抗性及与转Bt基因棉抗虫性的关系

用饲料感染法建立了棉铃虫Helicoverpa rmigera(Hubmer)敏感品系(SUS1)对Bt生物农药的敏感毒力基线和区分剂量,1995年测定了五省六县棉铃虫初孵幼虫对Bt生物农药的敏感性,结果表明：山东阳谷、河北邯郸、河南新乡、安徽萧县及江苏丰县棉铃虫已产生早期抗性,抗性个体百分率为5%～10%,与敏感品系相比,LC₅₀值稍有增加,但斜率b值明显变小;而江苏东台棉铃虫仍属敏感。这是国内外首次诊测到棉铃虫对Bt生物农药抗性。用棉叶喂饲法测定比较了转Bt基因棉花品系对不同种群棉铃虫的抗虫性效果,结果表明：用早期抗性的阳谷和新乡棉铃虫初孵幼虫接虫5d后平均死亡率较敏感品系下降16%～29%,说明棉铃虫对Bt农药与转Bt生物基因棉花品系间存在交互抗性。还讨论了Bt农药的抗性治理对策。     

Bt杀虫蛋白对不同品系棉铃虫和中红侧沟茧蜂生长发育的影响

以棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)室内敏感品系和田间品系为寄主,研究了亚致死浓度的Bt杀虫蛋白对中红侧沟茧蜂Microplitis mediator (Haliday)生长发育的影响。结果表明： 当寄主一直取食,或者在被寄生前12小时开始取食含Bt杀虫蛋白浓度为0,0.5,1.0, 2.0,4.0,8.0 μg/g的饲料时,与对照相比,中红侧沟茧蜂的卵-幼虫历期延长,茧重和成虫体重降低,成虫寿命缩短,但对茧期没有明显影响。Bt杀虫蛋白能有效抑制两个棉铃虫品系幼虫的生长,显著降低棉铃虫蛹重;当Bt蛋白浓度为4.0 μg/g时,显著降低棉铃虫化蛹率。用转双基因抗虫棉SGK321（表达Cry1A+CpTI蛋白）饲喂两个棉铃虫品系初孵幼虫,室内品系的第2、3、4和5天校正死亡率分别为48.5%、87.8%、96.6%和 95.8%,显著高于田间品系（30.9%、59.6%、80.9%及86.1%）。本研究表明,不论是田间品系还是室内品系,棉铃虫取食含Bt杀虫蛋白的饲料后,对中红侧沟茧蜂的生长发育都具有显著的负面作用。     

抗烟青虫转基因烟草的培育

烟青虫属鳞翅且(Lpidoptera)昆虫。前人研究表明,苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)中的Bt毒蛋白对其具有很强的毒杀作用。设法将Bt基因导入到烟草中,是防治这类虫害的一种有效途径。80年代后期以来,为了提高Bt基因在植物中的表达水平,在编码区密码子的优化、编码顺序的改进和高效启动子的选配方面．都有了很快的发展。有些经过部分改进或人工全合成的Bt基因,还被先后导入到番茄〔1.2〕、烟草〔2-4〕、棉花〔5.6〕、玉米〔7〕、水稻〔8〕等重要作物中。迄1995年止．在美国获准可供商业用的Bt毒蛋白转基因作物已有槔花、玉米和马铃薯等〔9〕。在烟草中迄今未见有Bt毒蛋白转基因株达到生产实用水平的报道。本实验试图通过农杆菌介导法,将密码子经过优化的Bt基因cryIA(b)及cryIA?〔10〕叫导入离体培养的烟草叶片,然后使之再生,形成转基因植株,再从其后代中选育出既保留原品种优良农艺性状,又具有对烟青虫稳定抗性的转基因株,以期提高该品种的稳产性,降低杀虫农药成本。保护烟田的良好生态环境。     

Bt毒蛋白在转Bt基因棉中的表达及其在害虫-天敌间的转移

以常规棉泗棉3号作为对照,采用酶联免疫生测法（ELISA）和室内生物测定法,研究了转Bt基因棉新棉33B和GK-12不同组织器官中Cry1Ac或Cry1Ab毒蛋白的表达及其向靶标害虫（棉铃虫）、非靶标害虫（棉蚜）以及天敌（龟纹瓢虫）的传递和影响。研究结果表明,新棉33B各组织器官中Bt毒蛋白的表达量较高,为79.7～1 390.0 ng/g鲜重,GK-012较低为165～2640 ng/g鲜重。在花盛期,新棉33B各组织器官中Bt毒蛋白的表达量依次为：柱头、花 >子房、花瓣>群尖;而5～7叶期的初展嫩叶、现蕾初期的幼蕾及花铃期的幼铃表达量相当,而且与花盛期群尖的表达量没有明显区别。同样处于花盛期的GK-12,其各组织器官中Bt毒蛋白的表达量依次为：花药>柱头>花瓣>群尖>子房;而5～7叶期的初展嫩叶、现蕾初期的幼蕾及花铃期的幼铃表达量相当,而且与花盛期群尖的表达量没有明显差异。常规对照棉的幼铃、花药、柱头以及子房中痕量Bt毒蛋白的存在可能与传粉昆虫等的活动有关。在转Bt基因棉田采集的棉蚜和棉铃虫老龄幼虫,其体内均可检测到Bt毒蛋白;在新棉33B棉田采集的龟纹瓢虫幼虫和成虫体内也可检测出Bt毒素。当以Bt棉田的棉蚜饲喂龟纹瓢虫时,龟纹瓢虫的生长发育、存活以及繁殖等基本没有受到影响。     

转Bt/CpTI基因棉花抗虫性鉴定与筛选

以国内育成和国外引进的52个转Bt/CpTI基因棉花品种(系)为材料,在河北农业大学棉花育种圃种植,采用室内生物鉴定方法,研究供试转基因棉花的棉铃虫抗性和甜菜夜蛾抗性,并进行抗虫性筛选.结果表明:国内育成的品种(系)在棉田二代棉铃虫危害期对棉铃虫的抗性不低于国外引进的品种(系);在三代棉铃虫危害期对棉铃虫的抗性,国内育成的品种(系)还略高于国外引进品种.新棉33B对甜菜夜蛾表现高抗,其他品种抗性一般.转Bt和CpTI的双价抗虫棉对甜菜夜蛾幼虫的抗性不高.根据供试品种(系)的抗虫性鉴定结果,筛选出SGK321等15个在二代、三代棉铃虫危害期对棉铃虫表现高抗的品种(系)和兼抗棉铃虫、甜菜夜蛾的新棉33B.     

转双价基因抗虫棉及其杂交F1代对棉铃虫幼虫的抗性研究

利用室内生物测定法和田间调查法研究双价抗虫棉及其杂交F1代不同生育期主茎功能叶和花铃期不同组织器官的抗虫性。结果表明:双价抗虫棉及其杂交F1代的抗虫性变化规律与B t基因棉的抗虫性变化规律相近,为生育前期(苗期、蕾期)抗性强,生育后期(花铃期、吐絮期)抗性弱,在花铃期为:棉铃>棉蕾>花>棉叶,且差异极显著。与B t基因棉相比,生育前期双价抗虫棉及其杂交F1代的抗虫性略弱,但差异不显著;生育后期双价抗虫棉及其杂交F1代的抗虫性显著强于B t基因棉。     

Bt毒蛋白对棉铃虫的生长发育和相关酶活性的影响

棉铃虫Helicoverpaarmigera幼虫取食不同浓度Bt毒蛋白的人工饲料后 ,随着Bt毒蛋白浓度的升高 ,幼虫的体重增长量和蛹重下降 ,死亡率明显上升。羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活力也呈升高趋势。在棉铃虫中肠内蛋白酶中 ,类胰凝乳蛋白酶的活力随Bt蛋白浓度增大而显著升高 ;类胰蛋白酶活性在Bt蛋白浓度为 2 0 μg g时达到最高 ,随后开始下降。     

肠道菌对苏云金芽胞杆菌杀虫活性的研究

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在生长发育过程中伴随芽胞的形成高效表达对昆虫具有特异毒性的杀虫晶体蛋白,从而被广泛应用于害虫防治上。有关Bt的杀虫机制,近年来有学者提出了肠道菌模型,认为肠道菌在Bt发挥杀虫活性中是必须的,也有人提出相反的观点。以棉铃虫作为供试昆虫,利用Cry1Ac10晶体蛋白研究了棉铃虫肠道菌在Bt杀虫过程中所发挥的功能。结果发现,在棉铃虫中肠道菌并非Bt杀虫所必需,并且在肠道菌存在的情况下,Bt杀虫活性反而明显降低,通过肠道菌回接试验发现5号肠道菌对棉铃虫的保护作用最为明显。     

人工释放赤眼蜂对棉铃虫的防治作用及相关生态效应

1998～2000年在河北省南皮县棉区转Bt基因棉田及常规棉田中设置4种不同的组合处理,通过释放螟黄赤眼蜂控制棉铃虫的方法,减少化学农药的使用,达到提升和增强自然生物控制力的生态效应;并以不采取任何防治措施的常规棉田为常规棉对照田。研究表明：（1）转基因棉和常规棉棉田中自然寄生率随棉铃虫世代的增加而逐渐升高,2、3和4代棉铃虫卵被寄生率范围分别为13.3%～14.3%、26.7%～28.2%和60.8%～61.4%。（2）棉铃虫2代期,在常规棉综防田释放赤眼蜂2次,其寄生率为46.4%, 比未释放赤眼蜂的转基因棉棉田和常规棉对照田提高33.1%和32.1%; 3代期,转基因棉棉田释放赤眼蜂1次,其寄生率与常规棉综防田释放4次的效果相当,分别为73.7%和68.1%;但与转基因棉不放蜂田、常规棉化防田及对照田相比,分别提高45.5%、61. 8%和47.0%;4代期,无论放蜂与否,各处理棉田中的寄生率除化防田外（52.1%）均在60%以上。（3）常规棉化防田棉铃虫2代和3代期,分别使用农药2和3次,其自然寄生率分别为5.5%和11.9%,与对照田相比,分别降低8.8%和14.8%;与常规棉综防田相比,分别降低40.9%和56.2%;释放赤眼蜂的效果与施药时间有关,放蜂后1天内施药,寄生率仅为12.5%,施药后2天放蜂,寄生率达45.6%。（4）转基因棉棉田棉铃虫累计数和百株蕾铃被害数比常规棉综防田分别减少74.8%和73.8%,捕食性天敌增加63.0%;放蜂Bt棉田比不放蜂Bt棉田棉铃虫累计数、百株蕾铃被害数分别减少61.8%和33.3%;常规棉综防田棉铃虫累计数、百株蕾铃被害数、农药使用量比化防棉田分别减少29.7%、43.4%和60.0%,捕食性天敌数量增加63.0%。（5）转基因棉田和综防棉田的益害比（捕食性天敌/植食性害虫）分别为0.47∶1和0.30∶1, 而化防棉田为0.24∶1。上述结果表明释放赤眼蜂可弥补抗虫棉后期抗性减弱的不足,增加田间自然天敌的数量,提高对棉田害虫的自然控害功能。     

Increasing tolerance to Cry1Ac cotton from cotton bollworm, Helicoverpa armigera, was confirmed in Bt cotton farming area of China

Abstract.  1. Changes in the frequency of Cry1Ac resistance genes and shifts in tolerance of cotton bollworm, Helicoverpa armigera , to the Cry1Ac toxin were assessed using bioassays of F₁ and F₂ offspring of isofemale lines from Anci County of Hebei Province (a multiple-crop system including corn, soybean, peanut, and Bt cotton) and Xiajin County of Shandong Province (an intensive Bt cotton planting area) in Northern China during 2002–2005.
2. A conservative analysis of the overall results indicated that there was a small increase in the frequency of major, non-recessive resistance genes over time.
3. The relative average development ratings [RADR – growth rate of a line on a Bt diet in proportion to the growth rate on a non-Bt (NBT) diet] of the bollworm larvae in F₁ tests increased significantly from year to year, indicating a gradual trend towards higher tolerance to Cry1Ac in the field populations.
4. There were also significant positive correlations between RADR of the lines in the F₁ generation and the RADR of their F₂ offspring, indicating that the tolerance was genetically based.
5. Quantitative genetic simulation analysis showed that resistance of H . armigera to Bt cotton in Xiajin could evolve to a high level in 11–15 years if no effective resistance management measures are carried out.     

棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达分析

【目的】通过对棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达谱分析,进一步明确Polycalin基因在抗性中发挥的作用,为棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性治理提供理论依据。【方法】通过RACE结合PCR技术克隆获得了棉铃虫Polycalin基因的全长序列,利用实时荧光定量PCR技术测定了在棉铃虫不同发育时期、幼虫肠道不同部位的Polycalin基因表达量,比较了棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料后,Polycalin基因表达量的变化。【结果】该基因全长序列为2 955 bp,开放阅读框为2 781 bp,编码926个氨基酸(Gen Bank登录号为KP100652);预测蛋白的分子量为101.68 ku,等电点为4.57。推导的氨基酸序列中,N末端含有20个氨基酸组成的信号肽,含有8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,C末端存在2个GPI结合位点。Polycalin在棉铃虫所有发育阶段都可以表达,幼虫期表达量较高,尤其在1~3龄幼虫体内表达量最高,在卵、成虫和蛹中的表达量较低。棉铃虫4龄幼虫取食含活化Cry1Ac蛋白的人工饲料后,Polycalin基因的表达受到抑制。【结论】研究结果可以为进一步揭示Polycalin基因的功能及其在Bt杀虫机制中的作用奠定基础。