菊花转抗虫基因植株的PCR快速鉴定

华中农业大学园艺与林学学院蒋细旺和包满球教授用PCR法快速鉴定了菊花转抗虫基因植株。他们对经过卡那霉素抗性筛选所得的菊花转苏云金芽孢杆菌蛋白Bt基因和转雪花莲外源凝集素GNA基因所得的抗性植株,利用改良SDS法提取菊花DNA,然后利用NPTII引物对6个菊花品种的抗性植株所得出的DNA进行PCR扩增,发现了符合NPTII基因片段大小的亮带,初步证实获得了转Bt基因和转GNA基因的菊花植株。     

用PCR法快速鉴定菊花转抗虫基因的植株

在生产实际中,菊花受害虫的危害很严重,用化学农药防虫,会使害虫产生耐药性、农药残留、次要害虫上升等恶性循环。为解决这个问题国外有少数人做了研究,我国也已开始。华中农业大学园林学院和江汉大学医学与生命科学学院蒋细旺、包满珠先生对此课题做了研究,他们对曾经过卡那霉素抗性筛选所得的菊花转苏云金芽胞杆菌毒蛋白Bt基因和转雪花莲外源凝集素GNA基因所得的抗性植株,利用改良SDS法提取菊花DNA,再用引物NPTII对6个菊花品种的抗性植株所提出的DNA进行PCR扩增,发现了符合NPTII基因片段的大小条带,这可在我国第一次证实已获得了转Bt基因和转GNA基因的菊花新植株。     

花粉管通道法介导PRSV-CP基因dsRNA转化番木瓜

以番木瓜‘蔬罗Ⅰ号’植株为受体材料,采用花粉管通道技术将番木瓜环斑病毒外壳蛋白(PRSV-CP)基因3′-端同源序列dsRNA转入番木瓜子房中。用PCR方法对T0代种子进行了分子检测,获得53株转基因番木瓜,转化率达到8.9%;对获得的T0代转基因番木瓜进行了田间抗病性鉴定,结果表明,转基因番木瓜植株对番木瓜环斑病毒(PRSV)表现为不同程度的抗性,可以推迟发病。     

黄瓜花叶病毒（CMV）运动蛋白基因介导的抗病性

利用Ｆｎｙ＿ＣＭＶ株系ＲＮＡ３ｃＤＮＡ克隆,构建了含有全长和编码区缺失５０１个核苷酸的运动蛋白（ＭＰ）基因植物表达载体ｐＢＭＰＲ和ｐＢＭＰＫ。在土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＳｍｉｔｈｅｔＴｏｗｎｓｅｎｄ）Ｃｏｎｎ）ＬＢＡ４４０４介导下转化烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）品种“ＮＣ８９”,分别经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ、ＲＴ＿ＰＣＲ或Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析,外源基因已整合到再生植株中并得到表达。抗病性分析表明,含有缺失型ＭＰ基因的Ｒ０代转基因植株抗性较好,接种５０ｄ后,１０株转化植株中仍有５株不表现症状。在自然发病条件下,这５个含有缺失型ＭＰ基因转基因株系在Ｒ１代都表现了一定的抗病性。抗性主要表现为症状出现推迟,严重度减轻。利用ＰＣＲ筛选、种子卡那霉素抗性试验和温室抗病性测定等方法,初步认为Ｒ２代转基因烟草Ｋ＿６＿５株系为转基因抗病纯合系。而含有全长ＭＰ基因的Ｒ０代转化植株,前期没有表现明显的抗病性,但在接种４０ｄ后部分发病植株有恢复健康的趋势。     

牡丹病程相关蛋白1表达载体的构建及遗传转化

为了对牡丹病程相关蛋白1（PsPRI）基因功能进行研究,构建了PsPRI基因超表达载体pBI121-PsPRI,通过农杆菌介导法将PsPR1基因转入普通烟草NC89中。经过抗性筛选和RT-PCR分子检测,获得含风PR1转基因植株。对转化烟草的T0代植株进行抗病性鉴定,发现转APRIJ基因烟草能轻微增强对烟草黑胫病的抗性,说明PsPRI基因具有抗烟草黑胫病原菌（Phytophthoraparasiticavar．nicotianae）的功能。     

转PvPGIP2基因小麦的获得与纹枯病抗性鉴定

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种植物防卫蛋白,可阻止一些病原真菌的侵害。本研究克隆出扁豆PvP-GIP2基因编码序列,构建了受玉米泛素(ubiquitin)启动子控制的PvPGIP2基因表达载体pA25-PvPGIP2;采用基因枪法将pA25-PvPGIP2转化小麦推广品种扬麦18幼胚愈伤组织4000块,获得了203株再生植株。PCR检测出阳性植株65株,转化率为1.625%。对转PvPGIP2基因小麦T1～T2植株,进行外源基因的PCR、RT-PCR、荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病抗性鉴定。结果表明,转入的PvPGIP2能够在转基因小麦中遗传、转录与表达;PvPGIP2基因的表达提高了转基因植株对小麦纹枯病的抗性。     

转不可翻译PVYN CP基因烟草的抗病性分析

我们曾报道表达不可翻译PVY~N CP基因的转基因烟草抗病性是由RNA介导的,其抗病性类似于转录后的基因沉默(PTGS)。本研究以这类不同抗性的Tn代转基因烟草植株为材料,对自交后的T1代转基因植株的遗传和抗病性进行了分析,并选取部分T_1代抗病株系自交留种。对T_2代RNA介导抗病性转基因植株进行了分子分析和一系列抗病性研究。结果表明,含1-2个转基因拷贝的T_0代感病植株,在T_1代中的Km抗性分离符合单位点插入的3∶1的遗传规律;含3个或3个以上转基因拷贝的T_0代中抗或高抗植株,在T_1代中的Km抗性分离符合多位点插入的15∶1或63∶1的遗传规律。大多数T_1、T_2代转基因植株的抗病性与转基因拷贝数成正相关,转基因在T_1、T_2代植株中能够转录表达,且转基因植株之间转基因mRNA在细胞质中的积累水平与转基因植株的抗病性成负相关。转基因植株的抗病性能够在T_1、T_2代中遗传,且T_2代转基因植株的抗病性具有以下特征:1)既抗病毒粒体又抗病毒RNA的侵染,且这种抗病性不受接种物剂量的影响;2)抗病谱较窄,只对PVY的某些株系具有高度抗病性;3)与传毒方式无关,既抗摩擦接种又抗带毒蚜虫接种;4)与植株的发育阶段没有关系。     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因（Bt—CpTI）甘蓝植株

以下胚轴,带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因（Bt-CpTI)导入甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株,经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明;农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株,经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究

根据植物偏爱密码子人工合成的纳豆激酶基因sNK和其中插入番茄果实特异表达基因E8第一内含子的纳豆激酶基因sNK-E8i,通过农杆菌侵染的方法转化到烟草NC89中。经PCR检测,得到12株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株,初步证明目的基因已整合到烟草基因组中;RT-PCR检测有9株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株为阳性;通过RT-qPCR将两种基因在烟草中的表达量进行比较,结果表明转sNK-E8i基因的植株中纳豆激酶的表达量比转sNK基因的植株中高;通过纤维蛋白平板法检测其活性,共有5株转sNK基因烟草植株和3株转sNK-E8i基因烟草植株检测到溶圈,说明目的基因在部分转基因烟草中可正常转录和翻译并表现出溶栓活性。经加代培养已得到T1代转基因植株。     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因(Bt-CpTI)甘蓝植株

以下胚轴、带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因(Bt-CpTI)导人甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株。经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明:农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株。经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

转拟南芥AtNPR1基因增强水稻对水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性

AtNPR1基因是拟南芥系统获得抗性的一个重要调节基因,在拟南芥中过量表达AtNPR1基因能使拟南芥对细菌和真菌的抗性同时增强.为了研究在水稻中过量表达AtNPR1基因对水稻抗病性的影响,将该基因转入到广西主栽籼稻恢复系品种桂99中.经PCR验证得到了79株转基因植株,DNA斑点杂交表明ATNPR1基因已经整合到桂99染色体DNA中.Northern杂交和RT-PCR分析表明,AtNPR1基因在桂99中已经表达;同时还检测了转基因植株对水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性,结果表明转基因植株对该两种病害的抗性均显著增强.     

转不可翻译PVY^N CP基因烟草的抗病性分析

我们曾报道表达不可翻译PVY^N CP基因的转基因烟草抗病性是由RNA介导的,其抗病性类似于转录后的基因沉默(PTGS)。本研究以这类不同抗性的T0代转基因烟草植株为材料,对自交后的T1代转基因植株的遗传和抗病性进行了分析,并选取部分T1代抗病株系自交留种。对T2代RNA介导抗病性转基因植株进行了分子分析和一系列抗病性研究。结果表明,含1—2个转基因拷贝的T0代感病植株,在T1代中的Km抗性分离符合单位点插入的3：1的遗传规律;含3个或3个以上转基因拷贝的T0代中抗或高抗植株,在T1代中的Km抗性分离符合多位点插入的15：1或63：1的遗传规律。大多数T1、T2代转基因植株的抗病性与转基因拷贝数成正相关,转基因在T1、T2代植株中能够转录表达,且转基因植株之间转基因mRNA在细胞质中的积累水平与转基因植株的抗病性成负相关。转基因植株的抗病性能够在T1、T2代中遗传,且T2代转基因植株的抗病性具有以下特征：1)既抗病毒粒体又抗病毒RNA的侵染,且这种抗病性不受接种物剂量的影响;2)抗病谱较窄,只对PVY的某些株系具有高度抗病性;3)与传毒方式无关,既抗摩擦接种又抗带毒蚜虫接种;4)与植株的发育阶段没有关系。     

转金属硫蛋白基因(MT1)烟草耐NaCl胁迫能力

为明确柽柳(Tamarix sp.)金属硫蛋白(MT1)基因过量表达对提高植物耐NaCl能力的作用,对转MT1因烟草进行分子检测和生理特性分析,结果表明具有卡那霉素抗性的转基因植株经RT-PCR Southern杂交均表现为阳性,说明外源MT1基因已整合到烟草基因组,并且得到了表达。金属硫蛋白基因的过量表达提高了转基因烟草植株的耐NaCl能力,表现为在含有150mmol/L和300mmol/L NaCl的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为转基因植株丙二醛(MDA)含量明显低于非转基因株系,而超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性比非转基因株系明显增加。     

CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性

以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析。此次以T,代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVY^N CP基因的沉默,而且CMV对PVY^N CP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVY^N CP基因沉默则未受到影响。采用ELISA方法对CMV PVY^N复合接种的转基因植株进行PVY^N检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为抗病。而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为感病。该文报道了在表达PVY^N CP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失。     

表达苏云金杆菌5－内毒素基因的转基因烟草的抗虫性

苏云金杆蓠(Bacillus thuringiensis)HD-1的δ-内毒索基因原始克隆THl2和TH48分别含有5．3kb和6．6kb型类同源异族基因。经定点突变改造其5’端,酶切对3’端进行缺失后,在大肠杆菌中仍能表达出有杀虫活性的被修饰的毒蛋白。将上述加工过的基因插入到双元载体pBin437(pBinl9的派生质粒)中,借助辅助Ti质粒(Pal,1404转人烟草,获得了抗卡那霉索的再生植株。经southern印迹和狭槽印迹(slot blot)杂交证明有1-5个拷贝的毒素基因整合至烟草染色体中。Northern印迹法分析结果表明这两类基医都在转基因植株中得到表达。育4株5．3kb类型,3株6．6kb类型的转基因植株对烟青虫有高抗性,与对照相比,这7株转基因烟草植株的杀虫率可达40一50％,并能显著抑制昆虫蜕皮和生长发育,表现明显的抗虫作用。结果表明这两类毒蛋白基因都可在植物中表达并赋予转基因植株以抗虫性。     

小麦抗白粉病相关基因的转化

利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因, 通过瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析, 优化了小麦幼胚愈伤组织的基因枪转化参数。小麦Beclin1类似基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST是2个在白粉菌诱导条件下具有增强表达特性的抗病相关基因。本实验进一步利用基因枪将ubi强启动子控制下的2个基因导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织细胞中, 使用除草剂经两轮选择培养基上的筛选和再生获得抗性植株, 进一步通过抗性植株的PCR分析获得转TaTBL基因植株5株, 转TaTST基因植株6株。转基因植株离体叶片的人工接种实验表明, 外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性, 表现为延缓了白粉菌的发育。利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因,通过瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析,优化了小麦幼胚愈伤组织的基因枪转化参数。小麦Beclin1类似基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST是两个在白粉菌诱导条件下具有增强表达特性的抗病相关基因。本实验进一步利用基因枪将ubi强启动子控制下的两个基因导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织细胞中,使用除草剂经两轮选择培养基上的筛选和再生获得抗性植株,进一步通过抗性植株的PCR分析获得转TaTBL基因植株5株,转TaTST基因植株6株。转基因植株离体叶片的人工接种实验表明,外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性,表现为延缓了白粉菌的发育。     

转三价抗虫基因彩色棉的获得

采用农杆菌介导法将外源三价抗虫基因Bt-CpTI-GNA导入彩色棉中,经分子检测已整合到受体植株体内,并已得到表达。目前已得到纯化株行。外源标记基因NPTII检测在T。代就有分离现象,各代检测淘汰3～4次才能基本清除分离株或非转化株。抗虫性检测表明转三价抗虫基因彩色棉对棉铃虫具有较高抗性,而对棉蚜则作用小大。     

转梅PGIP基因增强菊花抗病性研究

通过农杆菌介导法将梅多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(PGIP)转入盆栽小菊品种'05-44-2'中,以提高对真菌病害的抗性.经Hyg抗性筛选,获得232株抗性苗.对其中40株进行PCR检测,有8株扩增出目的条带;对这8株进行RT-PCR检测,发现其中有5个株系有目的条带出现,且发生基因转录.转基因菊花的抗病性检测证实,与对照相比,转基因株系对黑斑病有不同程度的抗性,表现为发病延迟,病情指数降低;株系7抗性最强,其苗期病情指数仅为33.     

根癌农杆菌介导天花粉蛋白基因TCS转化茎瘤芥的研究

以茎瘤芥(Brassica junceavar.tumidaTsen et Lee)的子叶为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,将天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)基因导入到茎瘤芥中。对所获得的31株抗性植株进行PCR扩增,其中阳性植株为23株;Northern blot分析结果表明基因TCS在转基因植株中能够正常表达。转基因植株接种病毒试验结果表明,转基因TCS的植株对芜菁花叶病毒TuMV的侵染有一定的抑制作用。     

翻译和非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较

利用RT－PCR方法克隆获得马铃薯Y病毒烟草叶脉坏死株系（PVY^N）的可翻译和不可翻译外壳蛋白（CP）基因,并分别插入pROKⅡ质粒中获得重组双元表达载体。通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的基因转化方法,将可翻译和不可翻译的PVY^N-CP基因分别导入烟草栽培品种NC89叶片组织中,得到抗卡那霉素的再生植株,对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行PCR检测表明,被导入可翻译和不可翻译CP基因的植株分别占卡那霉素抗性植株的95％和98％。攻毒实验表明,两种类型的转基因烟草对PVY^N的抗病性具有相似性,其表现型为：免疫、抗病和感病。免疫型转基因植株的抗病性不受接种物类型及其剂量的影响。Southern印迹杂交结果显示,目的基因已经整合到烟草基因组中。Northern印迹杂交证明,两种类型的CP基因都已在RNA水平上得到了表达,但细胞内RNA的积累量与转基因植株的抗病强度成负相关。Western印迹杂交表明,在表达不可翻译PVY^N－CP基因的转基因植株内 以CP蛋白,而在导入可翻译的PVY^N-CP基因的植株内检测到了CP蛋白,且CP蛋白含量与抗病性不存在正相关。本研究结果证明,表达可翻译与不可翻译PVY^N-CP基因的转基因烟草对PVY^N的抗病性均为RNA介导的抗病性。