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相似文献
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1.
用PCR方法扩增人微小纤溶酶原(Microplasminogen,mplg)cDNA,与分泌型酵母表达载体pHIL-D8重组,构成受醇氧化酶基因(AOX1)的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,然后转化GS115酵母菌,经表型筛选、PCR扩增筛选阳性克隆,然后以甲醇诱导表达,mplg分泌至培液,以酪蛋白-琼脂糖平板溶圈法、发色底物法检测,mplg显示出纤溶活性。  相似文献   

2.
t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达   总被引:3,自引:0,他引:3  
应用PCR方法,在tPAcDNA5′端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体pPIC9重组,构建表达质粒pSTEY,利用LiCl转化法转化酵母菌YS108,在MM和MD平板上筛选表型,PCR筛选tPAcDNA与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用SDSPAGE证明表达产物的分子量为6kDa左右,用酪蛋白板溶圈法测定tPA的活性。Muts表型菌表达产物活性最高为2500IU/ml,Westernblot证实表达产物具有天然tPA分子的免疫原性。  相似文献   

3.
用PCR方法从pPAIJ.7中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)基因,与pPUC18重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人PAI-2基因.PAI-2基因与表达载体pPIC9重组,构建受乙醇氧化酶1基因(AOX1)启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化GS115宿主菌,经表型筛选和PCR扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组PAI-2以分泌型表达,占分泌总蛋白的30%,具PAI-2抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗SDS复合物,具抑制纤溶的活性(91.4AIU/ml).对培养条件也进行了探讨.  相似文献   

4.
黑麦染色体的显微分离与PCR扩增   总被引:13,自引:0,他引:13  
利用改良的染色体显微分离技术,分离了黑麦(SecalecerealeL.)一个完整细胞的18条染色体(14A+4B),用人工合成的寡核苷酸为引物,进行单一引物法(singleuniqueprimerPCR,SUPPCR)扩增,经Southern杂交证明,PCR扩增产物与黑麦基因组DNA同源。  相似文献   

5.
构建截断型可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体(u-PAR)的原核及酵母表达质粒并分别在大肠杆菌和Pichiapastoris酵母中高效表达.利用PCR扩增截断型可溶性u-PARcDNA片段,并分别连入酵母及原核表达载体中,构建成表达质粒.后者经诱导表达的蛋白被用于免疫家兔,获得抗u-PAR的抗血清,用于对酵母表达产物的鉴定.前者在甲醇的诱导下表达,产物分泌至培养液中.结果表明,原核表达的u-PAR蛋白免疫家兔后获得高效价的抗血清,利用此抗血清所作Westernblot证实酵母表达蛋白具有u-PAR的免疫原性,表观分子量40kD左右.Mut-表型在第5d为最高(2.5μg/ml),Mut+表型在第4d为最高(7.5μg/ml).因此,构建的可溶性u-PAR表达质粒在Pichiapastoris酵母细胞获得表达,为进一步竞争拮抗受体功能的研究奠定了基础.  相似文献   

6.
t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
应用PCR方法,在t-PA cDNA5'端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体pPIC9重组,构建表达质粒pSTE-Y,利用LiCl转化法转化酵母菌YS108,在MM和MD平板上筛选表型,PCR筛选t-PA cDNA与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用SDS-PAGE证明表达产物的分子量为6kDa左右,用酪蛋白板溶圈法测定t-PA的活性。Mut^s表型菌表  相似文献   

7.
显微分离出黑麦(SecalecerealeL.)1R染色体,用CohesiveadapterssingleprimerPCR(CASPPCR)方法进行体外扩增,以DIG11dUTP标记扩增产物为探针,进行Southern分子杂交,结果表明扩增产物来自黑麦1R染色体。用1/10体积的连接物转化E.coliDH5α,获得10000多个重组菌落。经酶切分析,克隆子的插入片段为250~500bp,为进一步筛选1R染色体的分子标记打下了基础  相似文献   

8.
用PCR方法扩增人微小纤溶酶原(Microplasmingen,mPlg)基因,再与表达戴本重组,构造mPlg原核表达质粒并转化大肠杆菌,阳性克隆pSSE-mPlg经温度诱导表达,SDS-PAGE等方法证明表达产物的分子量约为29kDa占全菌总蛋白的24%左右,并在菌内形成包涵体,经半胱氨酸再氧化法和空气氧化法复法,表达产物的r-mPlg经SK作用后显示纤溶活性。同时对蛋白质浓度,复性时间等因素对  相似文献   

9.
大鼠OB基因克隆及其在大肠杆菌中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
采用RTPCR技术扩增大鼠OBcDNA编码区序列。PCR产物酶切后定向克隆至pUC19质粒。经核苷酸序列测定表明与文献报道的大鼠OBcDNA编码区序列一致。继之构建了pBV220rOB表达质粒并获得了OB基因在大肠杆菌中的特异表达。大鼠OB基因产物的获得为研究肥胖与某些非传染性疾病(如糖尿病、高血压病)间的关系提供了条件  相似文献   

10.
为了提高长效组织纤溶酶原激活剂(LAtPA)在转基因小鼠乳腺中的表达水平,将受控于羊β乳球蛋白(BLG)的LAtPA表达载体BLGLAtPA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因片段进行共注射,采用此方法建立的转基因小鼠,经PCR筛选和Southern印迹鉴定,获得3只LAtPA和WAP共整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的LAtPA表达,表达水平达到10μg/mL。  相似文献   

11.
中国人肥胖基因真核表达载体的构建   总被引:1,自引:0,他引:1  
为研究肥胖(obesity)的病因及肥胖基因(ob)的表达与调控,根据文献报道的hob序列设计引物,经RT-PCR扩增中国人的ob基因(包括信号肽在内的cDNA全长540bp),PCR产物采用T-A克隆法首先连接到克隆载体pUC119,然后定向转移到经改造的真核表达载体pSV-β-lacZ,酶谱分析表达克隆基因为的人肥胖基因。  相似文献   

12.
人白细胞介素—18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
利用反转录PCR(RTPCR)法从人肝组织中分离人白介素18(hIL18)基因。克隆到Tvectoreasy载体中,经酶切初步鉴定后进行DNA序列分析,结果表明与文献报道完全一致。以pBV220为表达载体,在大肠杆菌中高效表达了hIL18基因,重组蛋白占菌体总蛋白的27.2%。为进一步研究其生物活性奠定了重要基础。  相似文献   

13.
人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆,测序及表达   总被引:16,自引:1,他引:16  
用逆转录聚合酶链反应(RTPCR),以人胎肝组织总RNA为模板,扩增了人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,ZnSOD)的cDNA,并进行序列分析,将该hCu,ZnSODcDNA重组到T7启动子控制下的分泌型表达载体pET22b(+)中,构建表达质粒pETSOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。SDSPAGE及蛋白质印迹分析表明,经1mmol/L异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达一分子量为19kD的蛋白质,与抗人SOD多抗有特异的免疫反应,表达量约为菌体总蛋白质的30%,具有特异性SOD酶活性,酶活力可达1797u/ml培基。  相似文献   

14.
根据以发表的大鼠心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因(sMiMiCK)的cDNA序列,设计并人工合成一对特异性引物,以大鼠心肌总RNA为模板,反转录聚合酶链式反应(RTPCR)扩增出一段编码大鼠心肌sMiMiCK的DNA片段(1.33kb),将该片段克隆到载体pUC19上并进行初步鉴定,然后进行测序分析,结果与国外以报道的序列完全一致,证明已得到sMiMiCK基因,为今后sMiMiCK基因的表达创造了良好的条件  相似文献   

15.
应用PCR方法,扩增人纤溶酶原cDNA基因中K4K5 cDNA片段,与酵母表达载体pPIC9K重组,获得表达质凿p9kkk-18。该质粒转化毕赤酵母菌GS115,用G418-YPD筛选高拷贝表型,PCR筛选K4K5 cDNA与酵母染色体整全形成的阳性克隆,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达产物r-K4K5分子量约21.5kD,占分泌总蛋白80%以上,产物浓度为150-250mg/L。初步纯化产物抑制牛毛细血管内皮(BCE)细胞增殖与鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管生成。  相似文献   

16.
制备基因组DNAPCR模板一般都比较费工费时 ,研究人员尝试用微波炉提取真核生物基因组DNA ,然后做PCR扩增取得了较好的效果[1 ,2 ] 。本文描述了一个利用微波炉快速制备酵母质粒和基因组DNAPCR模板的程序 ,具有良好的重复性。1 材料与方法1.1 材料酿酒酵母菌种 1c163 6darg11,ura 3为比利时OrianeSoetens馈赠。酵母载体pYX13 3从美国康乃尔大学曹维国处获得 ,并由此构建了粗糙脉孢霉arg 13cDNA的酵母表达载体pYXA5。培养基为SD或YPD固体培养基。1.2 酵母质粒提取[3]取 1.5ml…  相似文献   

17.
青蒿转杜松烯合成酶基因发根系的培养   总被引:10,自引:2,他引:8  
将已克隆的棉花杜松烯合成酶的cDNA(cadC14)插入到植物表达载体pBI121中,构建含CaMV35S启动子驱动下的杜松烯合成酶基因的植物表达载体pBIC14。用含pBIC14质粒的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)15834感染青蒿(ArtemisiaannuaL.)叶片并诱导发根,共建立121个生长迅速的发根系。经浓度为20mg/L的Kan筛选,获得12个抗Kan阳性根系。PCR和Southernbloting分析表明,外源杜松烯合成酶基因已整合到青蒿基因组中,其转基因频率为3%。RTPCR分析表明,外源杜松烯合成酶基因在C37根系中,在转录水平上已有表达。  相似文献   

18.
目的:克隆含tPA中355个氨基酸密码子(1-3和176-527氨基酸)的cDNA序列(tPA355),将其在大肠杆菌融合蛋白表达系统中表达,并在体外复性使其具有激活纤溶酶原的生物活性。方法:采用RT-PCR技术从人黑色素瘤细胞Bowes中克隆出tPA355 cDNA,然后在pET32a(+)BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中表达,将表达出的融合蛋白Trx-tPA355(Thioredoxin,Trx)包涵体在体外进行变性、复性和纯化以使其具有激活纤溶酶原的生物活性。结果:测序结果表明本研究克隆的编码tPA中355个氨基酸密码子的cDNA序列与美国专利(公开号:5,587,159)中对应的序列完全一致,将其在pET32a(+)/BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中表达可获得稳定表达的融合蛋白Trx-tPA35  相似文献   

19.
用PCR方法从pPAIJ.7中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)cDNA,与pUC18重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人PAI-2cDNA.PAI-2cDNA与原核表达载体重组,构建原核表达质粒并转化大肠杆菌.经温度诱导表达,重组PAI-2占全菌总蛋白的14%,以可溶性形式存在,具纤溶抑制活性.工程菌发酵、压榨后,用硫酸铵分级沉淀,沉淀物经分子筛、离子交换和疏水性色谱的分离,每升菌液可获得约30mg纯度达90%的蛋白质,比活性为11866AIU/mg蛋白质,得率为19.2%.  相似文献   

20.
同源模建人微小纤溶酶原(microplasminogen ,mplg)的三维结构,建立葡激酶(staphylokinase,Sak),mplg计算机分子对接的结构模型,模型与已有的实验结果基本相符。为研究葡激酶N端结构与功能的关系,进一步改造葡激酶分子,根据复合物结构模型设计了N端缺失15个氨基酸的葡激酶突变体。  相似文献   

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