恒pH葡萄糖流加方法培养重组大肠杆菌生产人肿瘤坏死因子—α及？…

研究了一种新型的流加方法－恒ｐＨ流加葡萄糖法,用于培养重组大肠杆菌生产人肿瘤坏死因子－α。流动后培养液中菌体ＯＤ６００达到９．０,是在ＬＢ培养基培养的１５倍,而α－肿瘤坏死因子的比活保持（１．０５±０．１１）×１０＾５ｕ／ｍｇ,并建立了菌体生长的动力学方程。     

利用Ph电极流加葡萄糖培养重组大肠杆菌生产人α-肿瘤坏死因子的研究

应用一种新型的pH电极流加葡萄糖方法,用于培养重组大肠杆菌生产人α-肿瘤坏死因子。流加后培养液中菌体OD₆₀₀达到9.0,而α-肿瘤坏死因子的比活保持1.05±0.11×10⁵u/mg。与指数流加方法比较,二者能达到的最大菌体密度相近,而利用pH电极流加葡萄糖更具有设备简单,操作方便的特点。     

恒pH葡萄糖流加方法培养重组大肠杆菌生产人肿瘤坏死因子-α及其动力学研究

研究了一种新型的流加方法──恒pH流加葡萄糖法,用于培养重组大肠杆菌生产人肿瘤坏死因子-α。流加后培养液中菌体OD(600)达到9．0,是在LB培养基培养的15倍,而α-肿瘤坏死因子的比活保持（1．05±0．11）×105u/mg,并建立了菌体生长的动力学方程。     

蔗糖—葡萄糖双功能酶传感器的研究

结合蔗糖转化酶酶管与葡萄糖氧化酶－葡萄糖变旋酶双酶电极构成一种新的蔗糖传感器。该传感器可以分别用于蔗糖及葡萄糖的测定。蔗糖经酶管作用产生α－Ｄ－葡萄糖,再用ＧＯＤ－ＭＵＴ双酶电极定糖。若是样品中蔗糖和葡萄糖共存,比较样品流经不同路径时传感器的响应值,可以排除葡萄糖对蔗糖测定的干扰。传感器的最适ｐＨ和温度范围分别为：５．０－６．５和３０－４０℃,在稳态法实验中,传感器的线性范围为：２．５×１０＾－４     

人肿瘤坏死因子及其突变体的基因工程下游工艺研究

研究了重组人肿瘤坏死因子(rhTNFα)及其突变体[Lys²]-人肿瘤坏死因子[Lys²]-rhTNFα)的基因工程下游工艺。rhTNFα和[Lys²]-rbTNFα的温控表达工程菌株在B-BTaunE 10型15L自控罐中经发酵每升可得50g湿菌体。rhTNFα和[Lys²]-rhTNFα的表达水平仍能保持在50％以上,且表达产物为可溶性蛋白。所得菌体经超声破菌、硫酸铵沉淀,然后依次用DEAE—Sepharose FF、CM-Sepharose FF和Sephacryl S-200柱层析进行分离纯化,由每升发酵液菌体最终可得1g左右的纯品,纯度达到98％左右,rhTNFα的比活为～1.5×10⁸IU／mg,[Lys²]－rhTNα的比活为～6×10⁸IU／mg。     

一种新型人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达

采用多位点突变引物和ＰＣＲ方法对合成的人肿瘤坏死因子进行了突变,通过这一突变,人肿瘤坏死因子的第二位精氨酸的密码子ＣＧＴ被变为赖氨酸密码子ＡＡＡ,将突变后的基因插入表达载体ｐＳＢ－９２的ＰＬ启动子下游得到重组质粒ｐＳＢ－ＴＮＦ－Ｋ２,并在大肠杆菌中进行表达。突变体［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α的表达产率达到菌体内总蛋白质的６０％以上,且为一可溶性蛋白质并易于纯化。同野生型ｈＴＮＦ－α相比,［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α具有稍低的毒性,但对于某些人肿瘤细胞株表现出高于数十到数百倍的抑制活性．     

高密度发酵生产突变型重组人肿瘤坏死因子rhTNFα-DK2的研究

通过对发酵基质和发酵关键参数的优化,确定了发酵培养基的磷酸盐浓度为０．１５Ｍ,甘油浓度为１．２ｍｌ／Ｌ,补料中甘油浓度为２０ｍｌ／Ｌ,发酵过程中溶解氧控制在３０％～６０％,ｐＨ控制在６．８５左右。在５Ｌ在ＮＢＳ－Ｂｉｏｆｌｏ３０００型自动控制发酵罐中采取加速补料的补料分批培养,重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＳＢ－ＴＫ经１０ｈ３０°Ｃ培养和５ｈ４２°Ｃ诱导培养,最终密度达到６０ＯＤ６００,ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２的表达量占菌体总蛋白的５０％以上,每升发酵液纯化可得到近２ｇ的ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２。     

二茂铁－交联剂修饰的葡萄糖传感器

用年清白蛋白－戊二醛交联剂把葡萄糖氧化酶固定在Ｎａｆｉｏｎ－二茂铁修饰电极上,最后在电极上修饰一层Ｎａｆｉｏｎ膜,制备成葡萄糖传感器,电活物质如抗坏血酸,尿酸等对葡萄糖的测定无干扰。该传感器的线性范围为５．０×１０＾－＾４－１．３×１０＾－＾２ｍｏｌ／Ｌ,响应时间小于６０ｓ。     

利用固定化酵母细胞转化反式肉桂酸生产L—苯丙氨酸

研究了深红酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｒｕｂｒａ）的培养基成分,培养固定化及转化条件,实验表明最佳基成分（％）葡萄糖０．５,胰蛋白胨０．５,酵母膏０．５,磷酸二氢钾０．０５,Ｌ－Ｐｈｅ０．０５,ｐＨ７．０,３０℃２０Ｌ发酵罐中培养１５～１７ｈ,最佳固定化条件为：用２．５％卡拉胶包埋１８％的湿菌体,最佳转化条件为：１．０％反式肉桂酸,４ｍｏｌ／Ｌ铵离子,ｐＨ０．５,３０℃,用卡拉胶固定化深红酵母（Ｒ     

葡萄糖和肿瘤坏死因子-α对内皮细胞中早期生长反应基因-1表达的影响

目的探讨葡萄糖和肿瘤坏死因子-α对内皮细胞中早期生长反应基因-1表达的影响。方法利用人脐静脉内皮细胞体外培养,予以25mmol/L葡萄糖和/或10ng/ml肿瘤坏死因子-α与内皮细胞共同孵育,运用蛋白免疫印迹方法检测细胞中早期生长反应基因-1蛋白的表达,运用酶联免疫吸附法检测纤溶酶原激活抑制物-1的表达。结果葡萄糖和肿瘤坏死因子-α均可增加早期生长反应基因-1的表达,两种因素共同作用产生协同作用。而且,葡萄糖和肿瘤坏死因子-α也可促进纤溶酶原激活抑制物-1的表达。细胞外调节蛋白激酶1/2的抑制剂(PD98059)可下调肿瘤坏死因子-α所诱导的早期生长反应基因-1、纤溶酶原激活抑制物-1的表达,而对葡萄糖所诱导的早期生长反应基因-1的表达无明显影响。结论肿瘤坏死因子-α可能通过细胞外调节蛋白激酶1/2路径促进早期生长反应基因-1和纤溶酶原激活抑制物-1表达。肿瘤坏死因子-α和葡萄糖可能通过不同的信号通路调节早期生长反应基因-1、纤溶酶原激活抑制物-1表达,在肥胖、糖尿病等代谢紊乱所致的血管并发症的发生中起到重要的作用。     

放线菌果胶酶产酶条件及酶促反应条件的研究

从埋麻土壤中分离到放线菌２９８株,经初筛和复筛得到产酶活性较高的一株放线菌５－７１。最适产酶条件是：果胶０．５％,葡萄糖０．５％,蛋白胨０．５％,酵母粉０．１％,Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１％,ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％,ＮａＣｌ０．１％,ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０５％,ｐＨ８．０。２５℃培养３天达产酶高峰。通气量对产酶影响不大。酶促反应最适条件是：ｐＨ９．６,４５℃,底物果胶浓度０．７５％,作用时间９０ｍｉ     

利用恒溶氧．补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A

对表达人骨形成蛋白－2A(BMP－2A)的重组大肠杆菌YK537／pDH－B2m在500ml摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,继后用5L自控发酵罐进行分批培养和分批补料培养,以获取rhBMP－2A两种培养方式结果比较表明,在培养过程中保持30％～40％左右的溶解氧和限制性流加葡萄糖可以使BMP-2A的含量达到2．78g／L,最终菌体密度为OD₆₀₀53(相当于干菌21．2g／L),重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的25％。该培养技术的关键是：(1)在培养过程中保持适当的溶解氧;(2)限制性流加葡萄糖;(3)42℃起始诱导的时间控制在对数生长中期,持续表达时间为4h;(4)细菌持续生长的比生长速率控制在0．3h -1左右。     

大鼠红细胞葡萄糖代谢的异头物选择性

为研究大鼠红细胞对葡萄糖利用的异头物选择性及其作用机制,应用大鼠红细胞,对葡萄糖的两种异头物作了异构化速率、乳酸生成量、内流速度和大鼠红细胞已糖激酶作用下的磷酸化速度等进行了测定．结果指出,３７℃时大鼠红细胞的Ｄ－葡萄糖β－异头物和α－异头物代谢成乳酸的速度分别是０．２７μｍｏｌ／ｇＨｂ（３ｍｉｎ）和０．２１μｍｏｌ／ｇＨｂ（３ｍｉｎ）,即前者快于后者３０％．同时β－Ｄ－葡萄糖向红细胞内转运速度也快于后者：分别是５．０和３．５μｍｏｌ／ｇＨｂ（３ｍｉｎ）．大鼠红细胞已糖激酶的葡萄糖磷酸化速率实验结果指出：β－异头物比α－异头物快３０％;对于该两种异头物已糖激酶的Ｋｍ值均为５３μｍｏｌ／Ｌ．红细胞与α－和β－Ｄ－葡萄糖保温１ｍｉｎ后,其葡萄糖浓度均达到１ｍｍｏｌ／Ｌ左右,说明至少在１ｍｉｎ内对于已糖激酶的磷酸化此两种异头物的葡萄糖浓度均已饱和．这些结果提示,大鼠红细胞葡萄糖利用的β－异头物优选性主要与其磷酸化速度有关,而与其转运速度关系不大．     

巨大芽孢杆菌D01吸附金(Au3+)的研究

巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）Ｄ０１菌体吸附ＡＵ＾３＋的最适ｐＨ值为３．０,其生物吸附作用是一种快速的过程,最初５ｍｉｎ 的吸附量可达到最大吸附量的９５％,温度不影响该吸附作用。在ｐＨ３．０和３０℃、起始金离子浓度与菌体浓度之比为３０５ｍｇ／ｇ的条件下,吸附３０ｍｉｎ,吸附率达９９．１％,吸附量为３０２．０ｍｇ／ｇ干菌体。Ｄ０１菌体能将浓度中的Ａｕ＾３＋还原成Ａｕ＾０,在细     

人α－肿瘤坏死因子基因的高效表达

用人工合成的α－肿瘤坏死因子(TNF—α)基因构建了五个不同的表达质粒,它们不同之处是SD序列与起始密码子ATG问距离(D)各异．计算机模拟计算出翻译起始区域(TIR)中二级结构的最小生成自由能．以(D)为6个核苷酸时最小(绝对值)。它的表达效率也最高,产物TNF—α可达菌体总蛋白的60％．密码子的选用对表达效率有很大的影响,故人工合成TNF－α基因(选用大肠杆菌偏爱的密码子)的表达效率高于sc－DNA(对部分密码子改造的半合成eDNA)．     

补料分批法高密度培养凝结芽孢杆菌

研究在摇瓶条件下通过补加含有不同浓度的葡萄糖与酵母膏的料液及不同流加方式对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33菌体量和芽孢生成量的影响,确定了补料液中的葡萄糖与酵母膏比例为61(w/w),采用将葡萄糖浓度控制在3.0g/L～6.0g/L的流加方式进行高密度培养凝结芽孢杆菌.在5L自动发酵罐中进行补料分批培养,最终菌体浓度达到4.5×109cfu/mL,芽孢浓度为1.2×109cfu/mL,分别是分批培养的5.9倍和3.8倍.     

葡萄糖浓度对转基因聚球藻表达hTNF-α和光合作用的影响

为了开发海洋药物,把人肿瘤坏死因子-α（hTNF-α）转入海洋单细胞蓝藻聚球藻7002。然而,转基因聚球藻的hTNF-α表达率很低,仅为可溶性蛋白的0．08％,这不利于进一步纯化。不同浓度的葡萄糖对转TNF-α聚球藻的生长、hTNF-α的表达和光合作用的影响。当葡萄糖浓度为125mmol／L,hTNF-α的表达率达到最高,是不含葡萄糖的6.57。此外,当葡萄糖浓度为75mmol／L时,藻细胞的净光合作用速率达到最大,是光自养藻细胞的1.69倍。在各种葡萄糖浓度下,藻细胞对葡萄糖的吸收都不明显。     

1，6－二磷酸果糖产生菌的筛选及最佳培养条件的研究

１,６－二磷酸果糖（ＦＤＰ）广泛应用于治疗心血管疾病．本文进行了１,６－二磷酸果糖产生菌的筛选和最佳条件的研究。筛选出菌株ＨＹ２具有较高的产１,６－二磷酸果糖酶活力,高达１６０ｍｇＦＤＰ／ｇｗｅｔｃｅｌｌｓ,菌体生长的最适培养条件为：麦芽汁培养基糖度为１２柏林,培养温度为２８℃,ｐＨ６．０～６．５,菌体收率达７．０％左右。     

1,6—二磷酸果糖产生菌的筛选及最佳培养条件的研究

１,６－二磷酸果糖（ＦＤＰ）广泛应用于治疗心血管疾病。本文进行了１,６－二磷酸果糖产生菌的筛选和最佳条件的研究。筛选出菌株ＨＹ２具有较高的产１,６－二磷酸果糖酶活力,高达１６０ｍｇＦＤＰ／ｇ ｗｅｔ ｃｅｌｌｓ,菌体生长的最适培养条件为：麦芽汁培养基糖度为１２柏林,培养温度为２８℃,ｐＨ６．０￣６．５,菌体收率达７．０％左右。     

采用定位基因缺失突变技术在大肠杆菌中高效表达肿瘤坏死因子

肿瘤坏死因子α(TNF)为157个氨基酸组成的细胞因子,在克隆的全良cDNA的5’端有480bp的非编码区包括76个氨基酸信号肽编码区。本文采用寡核苷酸指导下的定位基因缺失突变方法,删除了这一非编码区及信号肽序列,并在成熟TNF分子第一个氨基酸密码前插入一个翻译起始密码(ATG),形成一个限制酶NcoI的识别位点ccATGG。然后取出含有成熟TNF全基因的Nc0I—Pst I片段,插入到原核表达载体pBv220中,获得了肿瘤坏死因子的高效表达菌株。活性检测结果表明,肿瘤坏死因子的表达量可达3．42×10。Μ／L菌液。sDs－PAGE电泳凝胶扫描结果显示,肿瘤坏死因子在大肠杆菌的表达量可占细菌可溶性总蛋白量的22．8％。抗呻瘤坏死因子单克隆抗体可以中和大肠杆菌表达的肿瘤坏死因子对L929细胞的细胞毒性。sD和ATG间插入31个核苷酸可使TNF表达量降低约10倍。