鸡胚胎干细胞的分离、培养和鉴定

SNL cells (permanent line of irradiated mouse fibroblast cells), primary mice embryonic fibroblasts (PMEF) cells and primary chicken embryonic fibroblasts (PCEF) cells were respectively used as the feeder cells for chicken embryonic stem cell culture. The isolated blastoderm cells front the stage X embryos of chicken were cultured in Dulercco‘‘ s Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with leukemia inhibitory factor (LIF, 1 000 IU/ml), basic fibroblast growth factor (bFGF 10 ng/ml) and stem cell factor (SCF, 5 ng/ml). The alkaline phosphatase (AKP) test, differentiation experiment in vitro and chimeric chicken production were carried out. The resuts showed that culture on feeder layer of PMEF yielded high quality CES cell colonies. The shape of typical CES clone showed as follows: nested aggregation (clone) with clear edge and round surface as well as close arrangement within the clone. Strong positive AKP reactive cellswere observed. On the other hand, the fourth passage CES cells could differentiate into various cells in the absence of feeder layer cells and LIF in vitro. The third and fourth passage cells were injected into the subgerminal cavity of recipient embryos at stage X. The manipulated embryos were incubated until hatching. Of 269 Hailan embryos injected with CES cells of Shouguang Chickens, 8.2 % (22/269) survived to hatching, 3 feather chimeras had been produced, which suggests that an effective culture systems were established and it could promote the growth of CES cells and maintain them in an undifferentiated state .     

鸡类囊胚获得及其生物学特性研究

鸡胚是研究胚胎发育、组织分化、基因表达与调控良好的实验模型, 是动物功能基因组学研究的重要材料. 实验选取白来航蛋鸡所产新鲜种蛋, 采用纸环法收集胚盘, 机械打碎后进行悬浮培养, 获得了哺乳动物囊胚样结构, 命名为类囊胚. 体外培养12~24 h是类囊胚发育的高峰期, 其直径显著增加近1倍. FBS可促进类囊胚的发育, 而卵黄在12 h前对类囊胚发育没有明显影响, 但到24 h时可促进类囊胚的贴壁生长. 经碱性磷酸酶(AKP)染色初步显示类囊胚中含有大量碱性磷酸酶活性的胚胎干细胞, 胚胎干细胞特异性表面标志SSEA-1免疫荧光染色后呈阳性, 进一步肯定了类囊胚中ES细胞的存在, 最终从贴壁类囊胚中分化出神经样和成纤维样等多种类型细胞. 由此可以得出: 悬浮培养鸡胚盘细胞可以形成含有胚胎干细胞的、类似哺乳动物囊胚样的结构, 并能保持其内胚胎干细胞的特性和分化潜能.     

bFGF诱导MEF生成的条件培养基对人胚胎干细胞生长的影响

为了探讨低浓度bFGF诱导小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）生成的条件培养基对人胚胎干细胞（hESC）生长分化的影响,以系列浓度的bFGF作用于MEF上,收集条件培养基（bFGF—MCM）,用于hES2细胞的无滋养层培养。以不添加bFGF而收集的MEF条件培养基（MCM）为阴性对照．同样浓度的bFGF添加于SR培养基（bFGF—SR）为空白对照。通过形态学特征和碱性磷酸酶染色法对hES2的生长分化状态进行评估。结果发现．培养一周内,未分化hES2克隆的比率,阴性对照为23％：空白对照组为13％-31％。当bFGF浓度为0．1,0．3,1,4ng／ml时,bFGF—MCM组未分化克隆的比率分别为44％,74％,77％和78％,与阴性和空白对照组相比,未分化克隆的比率均有不同程度提高．差异有统计学意义（P〈0．01）。该结果揭示了经bFGF诱导的MEF细胞所产生的条件培养基具备了维持hES细胞正常生长而不分化的能力。对bFGF—MCM的深入分析．有望更好地了解hESC的生长与分化机制。     

应用旋转生物反应器培养小鼠胚胎干细胞的初步研究

目的 应用旋转生物反应器(RCCS)和微载体培养体系尝试建立一种实现批量培养干细胞的新方法.方法 应用RCCS和微载体培养体系对小鼠胚胎干细胞(mESCs)进行体外培养扩增,定期收集细胞样品,镜下观察mESCs在RCCS生长的形态特征,并定量绘制细胞生长曲线,利用MATLAB软件计算细胞生长参数并对照平面培养体系,利用H&E染色、免疫荧光及RT-PCR技术对RCCS内培养的mESCs的细胞形态,未分化标志蛋白(SSEA-1)和标志基因(oct-4)的表达进行定性或半定量分析.结果 mESCs可在RCCS内以贴附于微载体表面的形式实现三维生长,其生长增殖状态良好,且伴随培养时间的延长,SSEA-1蛋白及oct-4 基因的表达水平逐渐降低.这表明RCCS内培养扩增的mESCs逐渐走向分化,该分化进程同步于平面对照培养体系.结论 RCCS可以为mESCs的体外规模化扩增培养提供良好的培养体系.     

不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响

目的:为探索鸡胚胎干细胞培养的优化条件,比较不同饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养的效果。方法:用传至第2代的鸡胚成纤维细胞与鸭胚成纤维细胞,经丝裂霉素处理后制作饲养层,比较这2种饲养层以及不用饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养效果的影响。结果:在以鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞作为饲养层的培养体系中,鸡胚胎干细胞均可保持良好的生长状态,而且2种饲养层对鸡胚胎干细胞克隆形成的影响差异不显著(P0.05)。结论:鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞均可作为较好的饲养层细胞用于鸡胚胎干细胞的离体培养。     

人胚胎干细胞建株与维持培养条件的优化

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞,它具有无限增殖、自我更新和全能分化的特性。无论在体内还是体外环境,人胚胎干细胞都能分化为机体几乎所有类型的细胞。基于其全能分化性,胚胎干细胞成为治疗各种退行性疾病的理想细胞来源。然而,在目前培养条件下所建立的胚胎干细胞株,仍然存在动物源性物质潜在污染的问题。因此,更优化的建株及培养条件十分重要。     

体外诱导鸡胚胎生殖细胞分化为神经干细胞

本研究探讨体外诱导鸡胚胎生殖细胞(EGCs)分化为神经干细胞(NSCs)的可能性.EGCs经类胚体(EB)阶段,以维生素A酸(RA)等进行诱导,在NSCs选择性培养基中筛培养扩增7 d,观察形态变化;采用RT-PCR法检测nestin基因表达及免疫细胞化学法检测nestin等NSCs特异性标志物,并对其扩增及分化能力进行观察.结果显示:EGCs经初级诱导,NSCs选择性培养基筛选培养7 d后,形成大量神经球样结构,可扩增传代;绝大部分神经球样结构呈nestin抗原阳性,表达nestin基因,且可分化为神经上皮样及少突胶质细胞.研究结果表明:RA等诱导的EGCs,经选择性培养基筛选培养可获得NSCs,有望为眼部神经变性疾病的治疗提供新的技术参考.     

人的类胚胎干细胞中碱性磷酸酶的检测方法和条件

检测人的类胚胎干细胞 (em bryonic stem cells,ES细胞 )中的碱性磷酸酶活性 ,以判别 ES细胞是否处于未分化状态 ,为分离和培养出高度未分化人的类胚胎干细胞 ,建立人类 ES细胞系 ,从而建立体外研究细胞分化和发育调控机制的模型提供方便。本文对检测 ES细胞中碱性磷酸酶活性的钙钴法和α-奈基磷酸技术方法和条件进行了探讨。结果显示 :检测 ES细胞中的碱性磷酸酶用α-奈基磷酸法较钙钴法为好 ,操作更简单 ,不会出现假阳性。分离和培养出高度未分化人的类胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞 ) ,建立人类 ES细胞系 ,再定向诱导其…     

胚胎干细胞分化为肝细胞的研究进展

目前 ,细胞移植作为终末期肝病的辅助治疗方法 ,移植的细胞必须满足在受体肝脏中存活、增殖并可分化为成熟肝细胞两个重要条件 ,但目前应用的肝细胞来源有限 ,其功能随着培养时间的延长而逐渐下降等问题限制了这一治疗策略的广泛开展。作为具有发育全能性和无限增殖能力的细胞 ,胚胎干细胞向肝细胞的分化研究近年来引起了广泛的关注 ,并取得了较大的进展 ,寻找合适、高效的分化诱导方法是目前研究的热点之一。胚胎干细胞向肝细胞的分化研究既可以为临床细胞替代治疗提供合适的细胞来源 ,也可以在药物评估和肝脏发育分化基础研究方面起到重要的作用。通过概括肝脏和拟胚体分化发育的分子机制 ,对体外胚胎干细胞向肝细胞分化的几种诱导体系作了介绍 ,并对分化肝细胞的应用前景和存在的问题进行了讨论。     

小鼠胚胎干细胞的培养

目的:建立小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)的培养方法。方法:制备G418抗性的原代小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理后成滋养层细胞,将小鼠胚胎干细胞复苏后,应用含白血病抑制因子的ES细胞培养液,培养小鼠ES细胞,观察集落的生长情况,并在光镜下观察细胞形态。结果:小鼠胚胎成纤维细胞生长良好,ES细胞呈克隆状生长,且保持未分化状态。结论:建立了小鼠胚胎干细胞培养的有效方法,为下一步基因打靶奠定基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞条件培养液促进心肌细胞肥大

体外模拟心肌缺血微环境,研究骨髓间充质干细胞(MSCs)的旁分泌作用对心肌细胞的影响。以大鼠MSCs各时间点的条件培养液刺激心肌细胞,观察心肌细胞蛋白含量、[3H]-Leu掺入、ANF-荧光素酶(luciferase)表达和心肌细胞面积的变化。MSCs条件培养液处理心肌细胞后,与对照组相比较6h及9h时间点的条件培养液可明显增加心肌细胞蛋白含量、[3H]-Leu掺入、ANF-荧光素酶表达以及心肌细胞面积,其中以6h时间点条件培养液的作用最为显著(P<0.01)。MSCs条件培养液能够通过旁分泌作用刺激心肌细胞肥大,此现象提示移植入心肌缺血区MSCs可能通过旁分泌作用影响心肌细胞,从而参与细胞移植后心功能的改善。     

人胚胎干细胞培养体系的研究进展

人胚胎干细胞具有广泛的研究前景,建立一个理想的人胚胎干细胞培养系统是利用它的前提.较详细地对目前关于人胚胎干细胞培养体系的研究进展、一些细胞因子对人胚胎干细胞的作用和影响以及体外长期培养对人胚胎干细胞核型的影响进行了综述.     

未成熟钠通道调控大鼠胚胎神经干细胞分化

钠通道在各类神经元上高表达,参与细胞多种生理功能的调节,是神经元实现功能活动的基本单位．未成熟神经元上钠/钙通道所诱发和自发的电位活动对后期的发育成熟至关重要．然而,发育中的钠通道是否参与神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化的调控尚不清楚．本研究证明,未成熟的钠通道参与NSCs分化调控．Western印迹结果显示,在分化第1,3,5,7 d的NSCs上钠通道和胞外信号调节激酶（ERK）的蛋白表达与分化时间正相关.免疫组化结果发现,与对照组比较,加入电压门控钠通道阻断剂TTX可明显下调NeuN、GFAP和Gal-c在NSCs中的表达（P＜0.05）,提示钠通道参与NSCs分化的调控.当采用veratridine激动钠通道后,激光共聚焦检测到细胞内Ca2+浓度明显升高,免疫组化和Western印迹结果显示细胞内Ca2+浓度明显升高,p-ERK表达量明显上调;相反,TTX可明显阻断Veratridine所引起的细胞内Ca2+浓度上调,并使p-ERK峰值明显降低和延后（P＜0.05）．研究结果表明,未成熟钠通道可通过激活ERK信号途径促进NSCs的分化．钠通道的这种作用可能是由钙离子介导的,其详尽机制有待进一步研究．     

无血清无饲养层条件下培养小鼠胚胎干细胞

目的研究在无血清无饲养层条件下小鼠胚胎干细胞的培养方法,为最终建立无血清无饲养层培养系统打下基础。方法比较小鼠胚胎干细胞ES-S8株在无血清培养体系和有血清培养体系中的生长情况,分析ES-S8细胞克隆形成效率,测定其生长速度;然后在撤去血清和饲养层的条件下培养ES-S8细胞,进行AKP染色和表面标记物SSEA-1免疫荧光检测。结果ES-S8细胞在无血清培养条件下细胞生长速度减缓,克隆形成率降低,但AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性;在无血清无饲养层条件下ES-S8细胞培养仍能形成克隆,且AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性。结论研究表明ES-S8细胞能够在无血清无饲养层的培养条件下生长,保持其良好的未分化特性。     

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be fed every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.Download video file.^{(109M, mp4)}     

鸡胚胎原始生殖细胞体外培养

以14-15期鸡胚血液为材料,采用Ficoll密度梯度离心方法,提取鸡胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs),在无基质细胞和基质细胞上分别进行体外培养。从实验结果可以看出：在含有胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、鸡血清(chicken serum,CS)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人胰岛素样生长因子(hIGF-1)、小鼠白血病抑制因子(mLIF)和青,链霉素双抗的M199培养液中培养时,鸡PGCs最多能够存活4天：当采用细胞因子和5天鸡胚胎性腺基质细胞共培养时能存活23代且每代细胞增殖可达近10倍。提纯后的PGCs细胞冻存复苏后,经台盼蓝染色鉴定存活率可达80％左右。     

大鼠精原干细胞的微滴培养法

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）作为成体干细胞的一类,既具有自我更新和分化的潜能,又可向子代传递遗传信息。阐明其增殖过程及分化特性对SSCs的进一步应用具有重要意义。小鼠SSCs的微滴培养研究显示,微滴培养技术与常规培养方法相比具有独特的优势。然而其他物种的SSCs能否实现微滴培养尚有待证实。该研究旨在利用微滴培养法建立大鼠SSCs体外培养技术。5、8、10、20、40个大鼠SSCs分别置于20此微滴中培养,用丝裂霉素处理的STO细胞作为滋养层。倒置显微镜观察记录大鼠SSCs的增殖状态。一个月后,对微滴培养的SSCs进行免疫荧光双标记染色鉴定。结果显示,一个微滴内接种5个SSCs就能实现扩增培养;培养一个月后,SSC仍然表达其特异的标记基因分子如CDH1、OCT4、PLZF、Thy1和Gfra1。体外诱导分析显示,微滴培养的大鼠SSCs具有分化为精母细胞的能力。大鼠SSCs微滴培养法的建立,为其他物种SSCs的培养提供了借鉴,也为再生医学和生命科学相关领域的研究提供了技术平台。