人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

获得人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc(FGFR2Ⅲc)及其S252W突变型重组腺病毒,感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,为下一步研究FGFR2Ⅲc基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含FGFR2Ⅲc基因的质粒为模板,PCR扩增得到FGFR2Ⅲc基因,重叠延伸法PCR获得FGFR2ⅢcS252W突变型基因;分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2Ⅲc和pAdTrack-FGFR2ⅢcS252W,DNA测序证实。Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组,得到的重组表达质粒Ad-FGFR2Ⅲc和Ad-FGFR2ⅢcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,通过GFP报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度,进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明,成功构建了人FGFR2Ⅲc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体,获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞,并表达目的基因。MTT结果显示FGFR2Ⅲc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖,S252W抑制效果更加明显。流式细胞术表明FGFR2Ⅲc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖。     

含人纤溶酶原K5基因的腺病毒载体制备和功能研究

应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5 cDNA基因,与真核表达载体pcDNA3重组,形成重组质粒pcDNA3K5,与穿梭质粒pShuttle 重组得pShuttleK5,经与腺病毒DNA重组,PCR鉴定正确,即为pAdK5。脂质体法将其转染293细胞后,制备细胞裂解液;噬斑分析法测定病毒滴度为5×10⁸ pfu/mL。将病毒以不同的感染系数(MOI)感染人脐静脉内皮细胞株ECV304和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,MTT法检测两者的增殖情况：ECV304细胞增殖受抑制,而MDA-MB-231细胞增殖未受明显影响。将感染病毒的ECV304细胞接种于ECMatrix^TM胶,显示内皮细胞分化和毛细血管管腔形成受抑制。表明所构建的含人纤溶酶原K5基因的重组复制缺陷型腺病毒具有抑制ECV304细胞增殖、分化和管腔形成的作用而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。     

miR-29b2c重组腺病毒的构建及对胃癌细胞增殖和迁移的影响

构建了miR-29b2c重组腺病毒Ad-miR-29b2c,考察了其对HGC-27、MGC-803胃癌细胞增殖及迁移的抑制作用。采用PCR从基因组扩增miR-29b2c片段,并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-29b2c,经酶切及测序鉴定。穿梭质粒经PmeⅠ线性化后与腺病毒骨架载体共转化BJ5183感受态,产生重组腺病毒质粒Ad-miR-29b2c,再经PacⅠ线性化后转染293A细胞进行包装。重组腺病毒扩增后感染HGC-27细胞,通过MTT及细胞迁移实验观察Ad-miR-29b2c对HGC-27、MGC-803细胞增殖及迁移的影响。采用Western blotting检测Ad-miR-29b2c对HGC-27、MGC-803细胞δ-catenin蛋白表达的影响。酶切、测序及荧光定量PCR结果表明重组腺病毒构建成功,miR-29b及miR-29c在HGC-27细胞过表达。MTT实验表明Ad-miR-29b2c能显著抑制HGC-27、MGC-803细胞增殖。细胞迁移实验表明Ad-miR-29b2c能显著抑制HGC-27、MGC-803细胞迁移。此外,Ad-miR-29b2c能显著降低HGC-27、MGC-803细胞δ-catenin蛋白表达水平。综上所述,构建了miR-29b2c的重组腺病毒,并发现其可以抑制胃癌细胞HGC-27和MGC-803的增殖及迁移,该作用可能与miR-29抑制HGC-27、MGC-803细胞δ-catenin蛋白表达有关。     

Ad-ERα-36-Fc-GFP的制备及鉴定北大核心CSCD

ERα-36是雌激素受体α新亚型,促进肿瘤细胞增殖、侵袭及耐药,可作为治疗靶点,但目前仅有小分子靶向药物研发。利用重组腺病毒携带诱饵受体,可进行靶向ERα-36的基因治疗探索。首先通过基因工程技术,构建可表达由Igκ信号肽引导分泌的重组融合蛋白ERα-36-Fc的穿梭质粒pDC316-Igκ-ERα-36-Fc-GFP;利用AdMax;腺病毒包装系统进行Ad-ERα-36-Fc-GFP腺病毒的包装、鉴定及扩增;感染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231并进行表达及功能验证。结果表明成功制备Ad-ERα-36-Fc-GFP重组腺病毒,可高效感染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,表达并分泌ERα-36-Fc重组蛋白,显著抑制EGFR/ERK信号通路。Ad-ERα-36-Fc-GFP腺病毒的制备为进一步开展靶向ERα-36的肿瘤基因治疗研究奠定基础。     

FGFR2Ⅲc重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞L6中的表达

目的:构建人FGFR2Ⅲc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2Ⅲc的重组细胞株,初步研究FGFR2Ⅲc对L6细胞的作用.方法:从人胎盘组织中获得FGFR2Ⅲc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR重组酶将重组的pENTR-FGFR2Ⅲc和表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应得到pLenti6/V5-DEST-FGFR2Ⅲc.将该重组表达载体和Viral Packaging Mix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293FT细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染L6细胞,杀稻瘟毒素筛选2～4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株.RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定重组细胞株中目的基因FGFR2Ⅲc的表达,bFGF和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组L6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系.结果:构建了舍人FGFR2Ⅲc基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染L6细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明L6中高表达FGFR2Ⅲc的重组细胞株的G1/G0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入Erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化.结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达FGFR2Ⅲc的重组L6细胞株,FGFR2Ⅲc通过Erk1/2和p38通路影响了L6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠L6细胞中研究FGFR2Ⅲc基因与成肌分化功能相关性奠定基础.     

BSP基因RNA干扰对乳腺癌MDA-MB-231BO细胞生物学特性的影响

旨在研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)基因表达后对人乳腺癌细胞MDA-MB-231BO生物学特性的影响。应用pSilencer5.1-U6Retro构建针对BSP基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒,将重组质粒转染293细胞制备病毒悬液感染MDA-MB-231BO细胞,利用嘌呤霉素筛选抑制BSP表达的乳腺癌细胞。Western blotting检测细胞内BSP蛋白表达,采用MTT法和集落形成试验检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果显示,成功构建BSP基因RNAi稳定转染的231BO-BSP27细胞。231BO-BSP27细胞内BSP蛋白表达抑制率为69.3%,与对照组细胞相比,231BO-BSP27细胞的生长速率和克隆形成率明显降低;S期细胞数量明显减少,G0/G1期细胞增多。由此证实,逆转录病毒介导的RNAi能实现BSP基因稳定沉默,从而抑制MDA-MB-231BO细胞的生长和增殖。     

重组p16腺病毒的构建及其对人白血病细胞的抑制作用

为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及野生型 p1 6基因的抗肿瘤特性 ,构建了复制缺陷型重组 p1 6腺病毒 .首先将 p1 6全长 c DNA插入穿梭质粒 p Ad CMV产生重组质粒 p Ad-CMV- p1 6,然后通过脂质体介导与 p JM1 7共转染 2 93细胞 ,经同源重组产生 E1区缺失的重组腺病毒空斑 .用纯化后的腺病毒感染人白血病细胞株 HL- 60后 ,PCR及 Western blot分析显示在感染细胞中有外源性 p1 6 c DNA存在和 p1 6蛋白表达 ;被感染的 HL- 60细胞的生长受到明显抑制 ,而未感染细胞及对照腺病毒感染的细胞没有受到抑制 .结果表明 ,腺病毒作为一种新型基因转移载体 ,可有效地介导肿瘤抑制基因 p1 6的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景 .     

人RARα基因重组腺病毒表达质粒的构建及其对人白血病NB4细胞的影响研究

利用AdEasy系统构建携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染人白血病NB4细胞后用生理浓度的维甲酸诱导,观察其对NB4细胞增殖和分化的影响。以急性早幼粒细胞株NB4的cDNA为模板,PCR扩增RARα基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα。用EcoR V和Sal I双酶切及测序鉴定,然后与骨架质粒AdEasy-1同时转化大肠杆菌BJ5183菌株的感受态,经同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-RARα。酶切验证后,Pac I酶线性化后转染AD293细胞,包装出重组腺病毒Ad-RARα,经3轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。流式细胞术测定病毒感染效率,Western blot法检测重组腺病毒感染的人NB4细胞中RARα蛋白和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达,CCK-8法检测重组腺病毒感染对NB4细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法测定细胞周期,PI测定细胞凋亡。重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα经双酶切及测序证明构建正确,病毒感染效率可达70%,与空载体感染及未感染的NB4细胞相比,重组腺病毒感染的NB4细胞内RARα蛋白的表达明显升高(P0.05),且经生理浓度全反式维甲酸ATRA处理后,能够有效地促进感染重组腺病毒细胞的分化成熟和凋亡。该研究成功构建了携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染NB4细胞后可促进细胞增殖,经生理浓度维甲酸诱导后能促进NB4细胞分化成熟和凋亡,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

Akt3稳定表达细胞株的建立及其对MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的 构建人蛋白激酶Bγ（Akt3）基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对MDA-MB-231细胞增殖的影响.方法 从流产胎儿脑组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增Akt3 cDNA的全长序列后克隆入pEGFP-N2质粒中,构建成Akt3基因真核表达载体,然后转染入MDA-MB-231细胞中,新霉素筛选稳定转染细胞克隆,通过MTT实验,研究转染Akt3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误.Western印迹检测结果显示AKT3融合蛋白在MDA-MB-231细胞中表达良好,而转染空载体及未转染细胞对照中未见有此融合蛋白质条带;MTT结果显示AKT3表达上调的稳定克隆组,其增殖活性显著高于空载体稳定转染细胞组及未转染亲代细胞组,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 Akt3过表达可增强MDA-MB-231细胞的增殖.     

构建MicroRNA-29a和microRNA-29c腺病毒并探讨其对膀胱癌细胞增殖能力的影响

构建miRNA-29a/c的重组腺病毒并观察其对膀胱癌T24细胞增殖能力的调控。以人全基因组DNA为模板,PCR扩增miR-29a、miR-29c,克隆至腺病毒穿梭载体pAdtrace-TO4-CMV。重组穿梭载体经pme I线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒pAdEasy-1-miR-29a、pAdEasy-1-miR-29c,pac I线性化后转染HEK-293细胞,进行包装和扩增。实时荧光定量PCR检测感染腺病毒的膀胱癌T24细胞中miR-29a、miR-29c的表达水平,并利用CCK-8实验检测细胞增殖能力。经DNA测序和限制性内切酶分析显示,重组腺病毒质粒pAdEasy-1-miR-29a、pAdEasy-1-miR-29c构建成功;感染腺病毒Ad-miR-29a和Ad-miR-29c后,经实时荧光定量PCR检测,膀胱癌细胞中miR-29a、miR-29c表达显著增高(P0.01);过表达miR-29a/c后的CCK-8实验显示,细胞增殖能力明显低于对照组(P0.05)。以上说明已成功构建miR-29a、miR-29c腺病毒,过表达miR-29a/c可抑制膀胱癌细胞的增殖。     

A soluble form of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) with S252W mutation acts as an efficient inhibitor for the enhanced osteoblastic differentiation caused by FGFR2 activation in Apert syndrome

Apert syndrome is an autosomal dominant disease characterized by craniosynostosis and bony syndactyly associated with point mutations (S252W and P253R) in the fibroblast growth factor receptor (FGFR) 2 that cause FGFR2 activation. Here we investigated the role of the S252W mutation of FGFR2 on osteoblastic differentiation. Osteoblastic cells derived from digital bone in two Apert patients with the S252W mutation showed more prominent alkaline phosphatase activity, osteocalcin and osteopontin mRNA expression, and mineralized nodule formation compared with the control osteoblastic cells derived from two independent non-syndromic polydactyly patients. Stable clones of the human MG63 osteosarcoma cells (MG63-Ap and MG63-IIIc) overexpressing a splice variant form of FGFR2 with or without the S252W mutation (FGFR2IIIcS252W and FGFR2IIIc) showed a higher RUNX2 mRNA expression than parental MG63 cells. Furthermore MG63-Ap exhibited a higher osteopontin mRNA expression than did MG63-IIIc. The enhanced osteoblastic marker gene expression and mineralized nodule formation of the MG63-Ap was inhibited by the conditioned medium from the COS-1 cells overexpressing the soluble FGFR2IIIcS252W. Furthermore the FGF2-induced osteogenic response in the mouse calvarial organ culture system was blocked by the soluble FGFR2IIIcS252W. These results show that the S252W mutation in the FGFR2 gene enhances the osteoblast phenotype in human osteoblasts and that a soluble FGFR2 with the S252W mutation controls osteoblast differentiation induced by the S252W mutation through a dominant negative effect on FGFR2 signaling in Apert syndrome.     

SOCS3基因重组腺病毒的构建及其在猪脂肪细胞中的表达

本研究旨在构建细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的重组腺病毒表达载体,获得有感染性的病毒颗粒。以pcDNA3-SOCS3质粒为模板扩增SOCS3基因,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经测序验证后,重组的穿梭质粒用PmeI酶切线性化后转化到BJ5183感受态细菌中与其内的骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,获得的重组质粒pAd-SOCS3,经PacI线性化后转染至HEK293细胞中进行包装和扩增,纯化后用TCID50法测定病毒滴度。以重组的病毒感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒载体pAd-SOCS3经酶切及PCR鉴定正确,病毒滴度为1.2×109PFU/mL;感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜观察可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western blotting检测到细胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表达显著提高。本研究成功构建了SOCS3基因的重组腺病毒,感染原代培养的猪脂肪细胞可稳定表达SOCS3蛋白,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础。     

MiR-22重组腺病毒的构建及对HepG2细胞葡萄糖摄取的影响

文中构建了miR-22重组腺病毒Ad-miR-22,分析了其对HepG2细胞胰岛素信号通路及葡萄糖摄取的抑制作用。通过PCR方法,扩增了miR-22的前体及侧翼序列,酶切后克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-22,经PCR及测序鉴定。穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,直接转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞BJ5183,产生重组腺病毒质粒Ad-miR-22,最后经PacⅠ线性化后转染包装细胞系293A。重组腺病毒经过3轮扩增后感染HepG2细胞,通过荧光定量PCR检测miR-22表达水平。通过葡萄糖摄取实验观察Ad-miR-22对HepG2细胞葡萄糖摄取的影响。采用Western blotting检测Ad-miR-22对HepG2细胞SIRT1在蛋白质水平的表达及GSK-3β磷酸化水平的影响。采用荧光定量PCR检测miR-22对PEPCK及G6Pase等基因在mRNA水平表达的影响。结果表明,重组腺病毒Ad-miR-22感染显著增加HepG2细胞miR-22表达水平。此外,Ad-miR-22显著抑制胰岛素诱导的HepG2葡萄糖摄取,并通过下调GSK-3β磷酸化抑制胰岛素信号通路的激活。Ad-miR-22反转胰岛素对糖异生关键酶表达的抑制作用,并下调SIRT1基因在蛋白质水平的表达。综上所述,构建了miR-22的重组腺病毒,发现其显著增加糖异生,抑制HepG2细胞葡萄糖摄取,该作用可能与miR-22调节SIRT1在蛋白质水平的表达有关。     

Apert syndrome mutant FGFR2 and its soluble form reciprocally alter osteogenesis of primary calvarial osteoblasts

Apert syndrome is characterized by craniosynostosis and syndactyly, and is predominantly caused by mutation of either S252W or P253W in the fibroblast growth factor receptor (FGFR) 2 gene. In this study, we characterized the effects of one of the mutations (S252W) using primary calvarial osteoblasts derived from transgenic mice, Ap-Tg and sAp-Tg, that expressed an Apert-type mutant FGFR2 (FGFR2IIIc-S252W; FGFR2IIIc-Ap), and the soluble form (extracellular domain only) of the mutant FGFR2 (sFGFR2IIIc-Ap), respectively. Compared to WT-derived osteoblasts, osteoblasts from Ap-Tg mouse showed a higher proliferative activity and enhanced differentiation, while those from sAp-Tg mouse exhibited reduced potential for proliferation and osteogenic differentiation. When transplanted with β-tricalcium phosphate (β-TCP) granules into immunodeficient mice, Ap-Tg-derived osteoblasts showed a higher bone forming capacity, whereas sAp-Tg-derived osteoblasts were completely deficient for this phenotype. Phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK), MEK, PLCγ, and p38 was increased in Ap-Tg-derived osteoblasts, whereas phosphorylation of these signaling molecules was reduced in sAp-Tg-derived osteoblasts. Interestingly, when these experiments were carried out using osteoblasts from the mice generated by crossing Ap-Tg and sAp-Tg (Ap/sAp-Tg), which co-expressed FGFR2IIIc-Ap and sFGFR2IIIc-Ap, the results were comparable to those obtained from WT-derived osteoblasts. Taken together, these results indicate that osteoblasts expressing FGFR2IIIc-Ap proliferate and differentiate via highly activated MEK, ERK, and p38 pathways, while these pathways are suppressed in osteoblasts expressing sFGFR2IIIc-Ap. Our findings also suggest that altered FGFR2IIIc signaling in osteoblasts is mostly responsible for the phenotypes seen in Apert syndrome, therefore these osteoblast cell lines are useful tools for investigating the pathogenesis of Apert syndrome.     

鼠重组磷脂酶D2腺病毒的构建及功能的初步研究

将磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D2基因及其功能缺陷点突变基因 (K75 8R)从真核表达载体pCGN中克隆至带有绿色荧光标记蛋白的穿梭质粒pAdTrack CMV中 ;再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组 ,成功构建磷脂酶D2重组腺病毒。该病毒颗粒感染人胚肾 2 93细胞 ,高效表达磷脂酶D2及其功能缺陷蛋白。这种表达对M3乙酰胆碱受体介导的细胞内磷脂酶D激活无影响。但磷脂酶D2功能缺陷蛋白对蛋白激酶C介导的胞内磷脂酶D激活有显著抑制作用 ;相反 ,磷脂酶D2蛋白有显著增强作用。结果表明     

FGFR2IIIc重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞L6中的表达

目的:构建人FGFR2IIIc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2IIIc的重组细胞株,初步研究FGFR2IIIc对L6细胞的作用。方法:从人胎盘组织中获得FGFR2IIIc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR重组酶将重组的pENTR-FGFR2IIIc和表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应得到pLenti6/V5-DEST-FGFR2IIIc。将该重组表达载体和Viral Packaging Mix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293FT细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染L6细胞,杀稻瘟毒素筛选2~4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株。RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定重组细胞株中目的基因FGFR2IIIc的表达,bFGF和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组L6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系。结果:构建了含人FGFR2IIIc基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染L6细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明L6中高表达FGFR2IIIc的重组细胞株的G1/G0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入Erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化。结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达FGFR2IIIc的重组L6细胞株,FGFR2IIIc通过Erk1/2和p38通路影响了L6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠L6细胞中研究FGFR2IIIc基因与成肌分化功能相关性奠定基础。     

Molecular Modification of Metadherin/MTDH Impacts the Sensitivity of Breast Cancer to Doxorubicin

BackgroundBreast cancer is a leading cause of death in women and with an increasing worldwide incidence. Doxorubicin, as a first-line anthracycline-based drug is conventional used on breast cancer clinical chemotherapy. However, the drug resistances limited the curative effect of the doxorubicin therapy in breast cancer patients, but the molecular mechanism determinants of breast cancer resistance to doxorubicin chemotherapy are not fully understood. In order to explore the association between metadherin (MTDH) and doxorubicin sensitivity, the differential expressions of MTDH in breast cancer cell lines and the sensitivity to doxorubicin of breast cancer cell lines were investigated.MethodsThe mRNA and protein expression of MTDH were determined by real-time PCR and Western blot in breast cancer cells such as MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-435S, MCF-7/ADR cells. Once MTDH gene was knocked down by siRNA in MCF-7/ADR cells and overexpressed by MTDH plasmid transfection in MDA-MB-231 cells, the cell growth and therapeutic sensitivity of doxorubicin were evaluated using MTT and the Cell cycle assay and apoptosis rate was determined by flow cytometry.ResultsMCF-7/ADR cells revealed highly expressed MTDH and MDA-MB-231 cells had the lowest expression of MTDH. After MTDH gene was knocked down, the cell proliferation was inhibited, and the inhibitory rate of cell growth and apoptosis rate were enhanced, and the cell cycle arrest during the G0/G1 phase in the presence of doxorubicin treatment. On the other hand, the opposite results were observed in MDA-MB-231 cells with overexpressed MTDH gene.ConclusionMTDH gene plays a promoting role in the proliferation of breast cancer cells and its high expression may be associated with doxorubicin sensitivity of breast cancer.     

腺病毒介导重组hKGF基因转染HaCat细胞及其表达

将PCR扩增得到的人角质细胞生长因子（hKGF）基因片断插入穿梭载体pAdTrack-CMV,产生重组质粒pAdTrack-CMV-hKGF,经Pme I线性化后,通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAdEasy-hKGF。采用Lipofectamine 2000将pAdEasy-hKGF转染到HEK-293细胞,在HEK-293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有hKGF基因。获得的重组hKGF腺病毒感染颗粒可高效感染HaCat细胞。Western-blot结果显示,重组腺病毒感染的HaCat细胞可分泌表达hKGF蛋白。