固氮酶钼铁蛋白铁钼辅因子的抽提研究进展

固氮酶由两种铁硫蛋白(钼铁蛋白和铁蛋白)组成。由还原剂提供电子经铁(Fe)蛋白传递给钼铁(MoFe)蛋白,在MoFe蛋白的活性中心部位进行N_2、C_2H_2等多种底物的还原[10,11,20]。MoFe蛋白中的Mo、Fe原子和酸不稳定性硫原子(S~*)组成2个M簇(FeM-oco)、3—4个P簇(P-cluster)及1—2个S(2Fe)簇。在底物还原过程中,这些原子簇都可能参与电子的传递。铁钼辅因子(FeMoco)已被认为是络合和还原底物的重要部位。因此,要阐明MoFe蛋白的作用机理就得研究FeMoco的结构和功     

钼,铁,硫化合物激活曝氧的棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的研究

曝氧后,棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白的催化活性和圆二色信号都显著降低,而吸收光谱则显著增加。与钼、铁、硫化合物和二硫苏糖醇组成的重组溶液保温后,曝氢蛋白的圆二色信号和吸收光谱几乎完全恢复至天然状态的同时,乙炔还原活性也得到了显著的恢复,表明重组溶液可使曝氧蛋白中的 P-cluster和其它活性部位都得到了不同程度的修复。     

固氮酶铁钼辅基理化特性的研究

在紫外可见光谱区内,固氮酶铁钼辅基〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（１２）Ｓ_（１２））４－〕均无特征吸收峰,不含高柠檬酸盐。含双钼的铁硫簇〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（６～１２）Ｓ_（６～１２））~（１～４）－〕的电荷数、颜色与该金属簇中的亚铁量成对应关系,并都有较高的生物重组活性．     

固氮酶铁钼辅基理化特性的研究

在紫外可见光谱区内，固氮酶铁钼辅基均无特征吸收峰，不含高柠檬酸盐。含双钼的铁硫簇的电荷数、颜色与该金属簇中的亚铁量成对应关系，并都有较高的生物重组活性。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白纯净铁钼辅因子的制备和性质

建立了以挥发性酸碱(TFA/NH_4OH)和NH_4OH碱化的NMF从棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白分离提取纯净铁钼辅因子(FeMo—co)的方法。得到了纯净FeMo-co的NMF制剂,从而证明了Tris、ClNa~ 、柠檬酸、HPO_4~(-2)、S_2O_4~(2-)以及氨基酸残基不为FeMo—co的有效分离和结构稳定所必需。制备的纯净FeMo—co的Fe/Mo比为8,比活为230nMC_2H_4/min/MoMn。由于分离制备的FeMo—co制剂除抽提溶剂NMF外不含任何其他成分,所以是进行FeMo—co结晶和结构研究的理想材料。     

保护固氮酶免受氧破坏的蛋白——Fe-S蛋白Ⅱ

固氧酶对氧极其敏感。特别是分离纯化后的固氮酶两组分——MoFe蛋白和Fe蛋白对氧的敏感性更加明显。被氧钝化后的固氮酶部分地或全部地失去固氮活性。但是,在自然界里存在于好气性自生固氮菌、光合固氮的藻类及豆科植物根瘤中的固氮酶却能在有氧的环境下     

铁氰化钾氧化固氮酶钼铁蛋白与铁、钼、硫化合物重组的研究

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白经铁氰化钾氧化后变为“漂白蛋白”,其活性损失约75％,同时释放出80％的钼和50％左右的铁。与铁、钼、硫重组溶液重组,金属组成和乙炔还原活性均得到明显恢复。穆斯鲍尔(M／issbauer)谱表明,重组溶液中的Fe、Mo、S已形成FeMc6原于簇的类似物,“重组蛋白”的M6ssbauer谱和天然MoFe蛋白相似。     

固氮酶钼铁蛋白羧基的化学修饰

在室温,pH6.4的条件下,钼铁蛋白迅速被大过量的Woodward试剂K所失活。紫外吸收光谱跟踪表明：随着时间延长,修饰程度不断加深。结合氨基酸分析结果算出当修饰2分钟时,活力丧失96%,有2—5个羧基被修饰。     

蓝藻固氮酶钼铁蛋白的研究

改进了蓝藻固氮酶的分离、提纯方法。首次用小型厌氧聚丙烯酰胺凝胶制备电泳法,代替常用的层析法,获取了电泳纯的蓝藻固氮酶钼铁蛋白,简化了程序,缩短了实验周期。SDS凝胶电泳和分子筛凝胶过滤测定分子量结果表明,钼铁蛋白分子量为360,000,由4个分子量为90,000的同一类型亚单位构成。每个钼铁蛋白分子含1个钼,18个铁和3290个氨基酸残基。其中酸性氨基酸占优势。研究了柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)固氮酶粗提物和钼铁蛋白的某些特性,其结果是:米氏常数为3.33×10~(-3)大气压乙炔,等电点为5—5.5。紫外、可见光谱与其它固氮生物的类似。盐对蓝藻固氮酶较之对其它固氮生物的固氮酶有更大的抑制作用。     

对与缺失铁钼辅基的固氮酶钼铁蛋白重组的原子簇的结构要求

棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）钼铁蛋白与邻菲口罗啉和Ｏ２ 保温并经凝胶柱层析后,成为部分缺失Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ和ＦｅＭｏｃｏ 的失活蛋白。由３ 个－ ＯＣＨ３－ 连结于Ｍｏ原子间的２ 个１Ｍｏ∶３Ｆｅ∶４Ｓ结构单位组成的原子簇与４Ｆｅ∶４Ｓ原子簇的混合液,以及由ＫＭｎＯ４、高柠檬酸铁、Ｎａ２Ｓ和二硫苏糖醇组成的重组液均可使这种失活蛋白明显恢复Ｃ２Ｈ２ 还原活性,但都不能使可被ＦｅＭｏｃｏ 激活的ｎｉｆＥ和ｎｉｆＨ 基因缺失突变种及ＵＷ ４５的Ａｐｏ－ＭｏＦｅ 蛋白得到激活。表明,不能合成ＦｅＭｏｃｏ 的固氮菌突变种蛋白只能与具有ＦｅＭｏｃｏ相似或基本相似结构的原子簇进行体外重组,而部分缺失金属原子簇的钼铁蛋白能与具有一定结构和组成的原子簇进行体外重组,变为具有催化氮还原能力的各种固氮酶组分蛋白。     

铁钼辅因子激活氧钝化钼铁蛋白的初步研究

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白氧钝化后,未断裂出任何含钼、铁原子的断片。用有机溶剂从钼铁蛋白中提取得到的铁钼辅因子(FeMoCo)可以激活被氧钝化了的钼铁蛋白,使其还原乙炔能力得到部分或完全恢复。这种激活作用的效率随着钼铁蛋白氧钝化程度的加深而降低。初步结果表明,氧钝化的钼铁蛋白中最先受到损伤的可能是 FeMoCo。如果氧钝化程度进一步加剧,其它部分也可能受到损伤。     

铁氧还蛋白-硫氧还蛋白系统

光为植物同化CO_2提供能量,同时,对一些基本的生化过程进行不同的调节。这一发现很重要,因为在叶绿体中,降解和合成碳水化合物的酶是共存的。因此,利用光来调节酶活性就保证了生物合成的酶(通     

固氮酶铬铁蛋白的晶体生长

在合适的结晶条件下 ,从含Cr无氨培养基中生长的固氮菌 (AzotobactervinelandiiLipmann)突变种UW3 中纯化出的CrFe蛋白可从溶液中析出深棕色斜四棱柱晶体 ,晶体最大的两条对角线长度分别可达 0 .2 5mm和 0 .12mm。PEG 80 0 0、MgCl2 、NaCl、Tris和Hepes缓冲液的浓度及结晶方法等对该蛋白的出晶率、晶核数目、晶体大小和质量都有明显影响。CrFe蛋白结晶所需的上述化合物的最适浓度与在Mn中生长的固氮菌突变种UW3 的MnFe蛋白和缺失nifZ固氮菌突变种的ΔnifZMoFe蛋白结晶所需的最适浓度有所不同。结果表明 ,该蛋白晶体可能为CrFe蛋白的晶体     

固氮酶铬铁蛋白的晶体生长

在合适的结晶条件下,从含Cr无氨培养基中生长的固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW3中纯化出的CrFe蛋白可从溶液中析出深棕色斜四棱柱晶体,晶体最大的两条对角线长度分别可达0.25 mm和0.12 mm.PEG 8000、MgCl2、NaCl、Tris 和Hepes 缓冲液的浓度及结晶方法等对该蛋白的出晶率、晶核数目、晶体大小和质量都有明显影响.CrFe蛋白结晶所需的上述化合物的最适浓度与在Mn中生长的固氮菌突变种UW3的MnFe蛋白和缺失nifZ固氮菌突变种的ΔnifZ MoFe蛋白结晶所需的最适浓度有所不同.结果表明,该蛋白晶体可能为CrFe蛋白的晶体.     

固氮酶铁钼辅基在分离纯化中结构变化的新证据

根据Ｋｉｍ－Ｒｅｅｓ模型［１］,固氮酶铁钼辅基（即ＦｅＭｏｃｏ或Ｍ簇）,是由一个ＭｏＦｅ３Ｓ３簇和一个Ｆｅ４Ｓ３簇通过三个Ｓ－桥联接而成．然而,自Ｓｈａｈ等（１９７７）首次从结晶的钼铁蛋白中分离出具有生物重组活性的ＦｅＭｏｃｏ以来,固氮研究者们一直致...