棒杆菌宿主中质粒不稳定性的研究

重组质粒pNAR4是由钝齿棒杆菌质粒pNAT65和大肠杆菌质粒pACYCl84构建的穿梭质粒。质粒pNAR4转化不同棒杆菌,在钝齿棒杆菌T6—13和答氨酸棒杆菌l0l47中为结构型不稳定,在钝齿棒杆菌B9中为分离型不稳定。而pNAT65转化谷氨酸棒杆菌10147后,转化于中的质粒分子大小及主要酶切位点与pxz10145相同。DNA杂交实验结果表明．在10147菌中有一种与z10145高度同源的超螺旋DNA组分,而这一组分与pxz10145的来源宿主中的另一小质粒具有相同的分子量。提出了质粒结构不稳定与宿主中存在的pxz10145高度同源的小质粒(超螺旋组分)有关,并提出产生质粒分子结构反复变化原因的假设。     

谷氨酸棒状杆菌质粒pXZ 10145的限制酶图谱和嵌合质粒的组建

从谷氨酸棒状杆菌中已经分离到质粒pxzl0145,该质粒带有氯霉素抗性。通过电子显微镜和BamH I酵切后在1％琼脂糖凝胶电泳上测定pXZl0145质粒的大小为5．3kb。用Bam—HI、PstI、EcoRI、saII等限制酶进行酶切,并用BamH I+sa1 I、BamH I+Pst I、Pst I+sal I、EcoR I+Pst I、EcOR I+BamH I等双重酶切,得到pxzlol45限制性内切酶的图谱。证明BamH I和Pst I为单一酶切点。将pxzl0 145与pBR322利用BamH I切点连接得到一嵌台质粒pxz34。这一质粒能在大肠杆菌中复制,在大肠杆菌中表现有氨苄青霉素和氯霉素的抗性,但是抗氯霉素的能力大大降低,只抗2Y／ml。     

棒杆菌质粒pXZ10145复制功能区定位

将棒杆菌质粒pXZ10145或pNAT65的不同酶切片段装入大肠杆菌质粒pACYCl77中构建了pTSK系列重组质粒。转化棒状类细菌的实验结果确定了质粒pXZ10145上复制必需区的位置。质粒pXZ10145复制最小必需区定位在NaeI-NruI的1.2kb片段上,在这个片段上只有一个约940碱基的阅读框架。它编码一个质粒复制因子,以对位作用方式协助那些不能自我复制但复制起始区仍保持完整的pTSK质粒在棒状类细菌中复制。质粒pXZ10145复制起始区在一个NaeI-SalI的0.3kb片段上,位于已确定的复制因子编码框架中。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段在枯草芽孢杆菌中的克隆和启动氯霉素抗性基因表达

黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum granulosis virus简称AsGv)DNA和pPL603质粒DNA,用限制性核酸内切酶EcoR I酶切后,再用T4连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BRl51感受态细胞。然后在loμg／m1氯霉素的sPBY选择平皿上筛选,得到了抗氯霉素的转化子。经过琼脂糖凝胶电泳检测,转化于中的重组质粒比原载体pPL603质粒分子量大。由于重组质粒上的抗性表达水平可达250μg／m1氯霉素,比pPL603质粒抗性表达水平(5μg／m1)提高50倍。所以重组质粒携带了有启动作用的DNA片段。启动功能片段的分子量,经琼脂糖凝胶电泳测定约为O．9kb。除进行DNA—DNA分子杂交确证外,并用重组质粒pAsGVPl5进行了第二次转化、抗性水平测定和分子量分析。     

质粒pXZ101 45DNA转化棒杆菌原生质体的研究

用SDS处理谷氨酸棒杆菌1014(Corynebacterium glutamicum 1014),获得消除质粒的衍生株1014—6。通过质粒pXZl0145(Cmr)转化1014—6菌株的原生质体,研究了转化最适条件。0．6u／ml青霉素处理对数期菌体可明显提高转化效率。转化促进剂PEG以分子量6000,浓度30％为最佳。转化在37℃水浴进行3min效果最好。转化效率最高可达2×104转化子/μg DNA。质粒pXZ10145电已成功地转入钝齿棒杆菌B9(C．Crenatu B9)。并在新 宿主中基本保持稳定。     

质粒pXZ10145核苷酸序列测定和分析

以Sanger双脱氧中止法为原理,利用美国ABI公司370A自动核酸序列分析仪,我们测定了谷氨酸棒杆菌质粒pxzl0145全长4887bp的核苷酸序列,该质粒上存在包括ApaI等18种限制酶的单一切点,其它限制酶切点的数目和位置也被定出,质粒上有8个可能的阅读框架,通过序列分析,我们确定了pxzlO145断裂生成缺失突变体pNAT65的两侧位点,在两个断裂点上发现存在“ATCTAGC”7个碱基的同向重复序列。     

谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭型启动子探测载体构建

从质粒pXZ10145和pUC19出发,构建了一个谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭载体pAK6。pAK6的大小为5684bp,带有卡那霉素和氨苄青霉素抗性选择标记,以及多克隆位点。在pAK6基础上,构建了以氯霉素乙酰转移酶为报告基因的启动子探测载体pAKC6,pAKC6的大小为6474bp。采用鸟枪法,将经Sau3AI消化的谷氨酸棒杆菌基因组片段连入pAKC6;根据谷氨酸棒杆菌对氯霉素的抗性,从中分离出两个具有启动子功能的插入片段。通过测定报告基因氯霉素乙酰转移酶的活性,对两个启动子片段在谷氨酸棒杆菌中的强度进行了初步的判断;测序后,用启动子预测软件对其结构进行了预测,证实了启动子序列的存在。     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/HindⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后回收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3.3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT-1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100%,解离后的质粒稳定性为93%。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

解淀粉芽胞杆菌启动基因的克隆及其对地衣杆菌α-淀粉酶基因的调控

用大肠杆菌启动基因探针质粒pHE5克隆了解淀粉芽胞杆菌的启动基因。供体菌DNA的HindⅢ片段与pHE5重组后转化大肠杆菌,获得一批带启动基因的抗四环素转化子,其中四株的抗性达到200μg/mL,从这四株高抗性转化子中提取质粒,并对其中的一个重组质粒pAE23的插入片段进行限制性图谱分析和缺失研究,获得了一个缺失了部份片段,四环素抗性仍达到200μg/mL的衍生质粒pAED23,经酶切分析证明其上的启动基因位于0.8kb的EcoR Ⅰ—HindⅢ片段上。点杂交分析证实该片段来自解淀粉芽胞杆菌的DNA。将地衣杆菌的α-淀粉酶基因亚克隆至pAED23启动基因下游的HindⅢ位点上能增强该基因在大肠杆菌中的表达。     

芽孢杆菌高表达质粒的构建及其性质的研究

以B.subtilis质粒pUB110为基础构建了双标记(Km²、cm²),多酶切点接头的表达质粒pNQl22和pNQll3系列。pNQl22的分子量为3．2×10⁶道尔顿,其对cm抗性水平和cat-86基因表达水平与质粒pPL600相同,pNQll3系列质粒分子量为3．1—4．1×10。道尔顿。其对cm抗性水平高于质粒pPL600,它们所携带的cat-86基因的表达水平无论在非诱导和诱导条件下部比pPL600高约5倍。无分解代谢阻遏现象,传代稳定,因而可以用作Bacillus属基因工程的载体。     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因的克隆和表达

我们分离到了一株产生分泌型青霉素G酰化酶的巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriumBM1)。用pBR322作载体,将该菌的青霉索G酰化酶基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coliMcl061)中,得到含有9．9kb插人片段的重组质粒pBmPA4。分析了该质粒的限制酶酶切图谱,并经体外缺失获得含4．9kb插入片段的质粒pBmPA5。pBmPA4和pBmPA5在E·coliMcl061中均能表达,表达受苯乙酸诱导。     

带有启动子DNA的片段在枯草芽孢杆菌中的克隆

用限制性核酸内切酶EcoR1酶切枯草芽孢杆菌168染色体DNA和pPL603质粒DNA然后用T4DNA连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BR151感受态细胞。在每毫升含有10微克氯霉素的SBPY选择培养皿上筛选,得到61个抗氯霉素的转化子。经快速琼脂糖凝胶电泳检测,从61个抗性转化子中得到49个比原载体pPL603质粒分子量大,并带有启动子DNA片段的重组质粒。测定了所有重组质粒表达的不同抗性水平,分析了部分质粒的一些特性,对抗性水平较高的7个重组质粒的分子量进行了测定,并用pBP61重组质粒DNA进行了第二次转化和酶切电泳分析。     

嗜碱性芽孢杆菌启动子的克隆及某些因子对表达的影响

从土壤中分离到一株嗜碱性芽孢杆菌(Bacillus sp. No．2),并初步分析了该菌的基本特性。以抗性基因启动子缺失质粒pG^_6为载体,从该菌的染色体DNA中,克隆了带有启动子的一些片段,并引入大肠杆菌得到表达。其中某些启动子的表达受到某些环境因子(如pH Nacl)的调控。     

通过接合作用质粒从大肠杆菌到棒状杆菌的转移

构建了可接合转移的穿梭质粒pXZ911、pBZ51和pBZ52。这些质粒中含有具转移功能的Mob片段和在棒状杆菌中复制的复制区。以大肠杆菌S17—1为供体菌,通过接合转移作用,可将这些质粒转移到谷氨酸棒杆菌ATCCl3032、谷氨酸棒杆菌ATCC21543、北京棒杆菌B3、北京棒杆菌1．299、裂氏棒杆菌B43、黄色短杆菌ATCC 14067等棒状杆菌苗株,接合转移频率分别为：9X10^-5,1X10^-4,8．5x10,2．3X10^-4×10^-5,2．9X10^-5。本文还探索了大肠杆菌和几种革兰氏阳性棒状杆菌问基因转移的方法、转移频率、影响转移频率的因素、宿主范围等问题。     

林可链霉菌中的同源重组

为研究链霉菌中的同源整合频率和机制 ,采用不能在链霉菌中复制的大肠杆菌质粒转化链霉菌StreptomyceslincolnensisB48。质粒pYYE0 4a1上携带的被硫链丝菌素抗性基因灭活的林可霉素生物合成基因与染色体DNA上的同源基因发生重组 ,经过低抗筛选 ,得到两个突变子S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2。进一步以硫链丝菌素抗性基因为探针杂交染色体DNASmaⅠ片段 ,S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2都得到 1 5kb的阳性条带 ;而以缺失的lacZ基因为探针杂交染色体DNAHindⅢ和SmaⅠ联合酶切片段 ,只有S .lincolnensisYY2得到 4 4kb的阳性条带。Southern杂交结果表明S .lincolnensisYY1是由同源交换或二次重组产生的 ,而S .lincolnensisYY2为同源整合的结果。为验证同源整合子上大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的存在 ,用SphⅠ酶切染色体DNA后连接 ,连接液转化E .coliJM83感受态细胞 ,在氨苄抗性板上得到 2个转化子 ,命名为pSLE1。对…     

芽孢杆菌原生质体作为质粒DNA转化的受体

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B3F 7658,短小芽孢杆菌(B. pumilus) AS 1.940,巨大芽孢杆菌(B．Megaterium) AS 1.941,和多粘芽孢杆菌(B. polymyxa) AS 1.878等菌株,既不能作为染色体DNA的转化受体,也不能作为质粒DNA的转化受体。用不同量的溶菌酶处理这些菌株形成原生质体,然后加pUB110质粒DNA,经聚乙二醇6000(PEG)诱导,在含新霉素(400μg／ml)的DM-3再生培养基上恢复细胞壁,培养48小时后,转化子数为1.0 x 103一4.6×105／μg DNA。若同时用PEG和Ca2+ 离子诱导,转化子数可提高2—3倍。质粒pUBll0用EcoRI酶切后,转化子数大大下降(2.0×102转化子／μg DNA)。Eco RI酶切后,用T4连接酶连成环状,转化子数有所增加(1．7×103转化子／μg DNA)。     

一株可提供分子量参照物的含多质粒不动杆菌

作者研究了一株有10种质粒的不动杆菌(Acinetobacter),其质粒的分子量分别为1．6、2．3、2．6、3．I、3．7、4．2、4．5、6．0、7．2和14．0Md．这套质粒在宿主中相当稳定,井能用简单方法提取,可以用作琼脂糖凝胶电泳中cccDNA的分子量参照物,其性能优于目前常用的E．Coli V517的质粒。     

杀蚊球形芽孢杆菌BS10的质粒限制图谱

本文报道一株国内分离的具有杀幼蚁活性的球形芽孢杆菌(Bacullus Sphaericus下文简称Bs)的大质粒(pFWl),其分子量为69．5×10⁶道尔顿,绘制了该质粒的xhol限制性核酸内切酶酶图。以苏云金芽孢杆菌以色列变种(Bacillus huringiensis israelensis下文简称BTI)75×10⁶道尔顿质粒为探针与泼菌株DNA进行核酸杂交,结果表明BTI与该菌株为毒素蛋白编码的基因序列之间无同源性,说明它们的进化来源是不相同的。     

一种基于温敏质粒的新型基因敲除方法

基于温敏型质粒而不用线性DNA的方法用于快速敲除沙门氏菌染色体上的目的基因。以伤寒沙门氏菌S.ty2基因组为模板扩增得到的ssaV基因的上下游同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段连接到温敏型质粒pHY304,共同构建同源重组载体;然后转化S.ty2,通过筛选得到带有抗性标记的重组菌。通过转入重组酶表达质粒pCP20,去除抗性标记,得到ssaV基因缺失的重组菌,并在 DNA 水平进行了鉴定。建立了一种改进的基于温敏质粒的沙门氏菌的基因敲除方法,此方法也值得在其他革兰氏阴性菌的基因敲除中尝试应用。     

一种新型可用于DNA分子量标准的质粒构建

将首尾带有EcoR Ⅰ酶切位点的2．0kb、1．5kb、1．0kb、0．75kb、0．5kb、0．25kb六个长度的片段逐步连接到pGEM-3zf( )质粒上的B．am H I位点中,构建的质粒用EcoR Ⅰ进行单酶切,经电泳可以获得七条DNA带与设计结果完全一致,可用于DNA电泳试验中分子量标准。