丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)研究进展

由于缺乏合适的HCV感染细胞模型,严重制约了HCV复制,特别是HCV复制的关键因子依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的研究.对HCV序列比较分析并通过异源表达证明NS5B是HCV复制的RdRp.NS5B C端疏水性氨基酸区域以及NS5B与细胞膜形成复合体等影响NS5B溶解性.在合适的反应条件下NS5B可以多种RNA分子为模板催化RNA复制,特别是能有效复制HCV全长(+)RNA.高浓度GTP激活HCV RdRp活性.NS5B N/C端缺失突变和保守性A、B、C区中的点突变影响RdRp活性,但D区345位精氨酸突变为赖氨酸时RdRp活性明显升高.HCV RdRp的发现及其功能研究为HCV药物研究提供了新型靶标.     

HCV NS5B蛋白对HCV RNA的模板特异性研究

在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达并纯化HCV的依赖于RNA的RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp,NS5B蛋白).以HCV正、负链RNA 3′末端的序列为模板,体外研究NS5B蛋白催化的RNA合成.结果显示,正链RNA在体外不能指导RNA合成,而负链RNA模板可以产生一条全长的正链RNA产物,表明NS5B对负链RNA具有模板特异性.NS5B对负链RNA的特异性在模板竞争性实验中得到进一步证实,正链RNA的存在和竞争对以负链为模板的RNA合成没有影响.这样,就合理解释了在HCV RNA复制时正链RNA的数量远比负链RNA多这一问题.同时,本实验的结果也为进一步研究病毒或其它细胞因子参与以正链RNA为模板进行的RNA合成,以及有关负链RNA模板特性的研究奠定了基础.     

HCV NS5B蛋白对HCV RNA的模板特异性研究

在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达并纯化HCV的依赖于RNA的RNA多聚酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp,NS5B蛋白)。以HCV正、负链RNA3′末端的序列为模板,体外研究NS5B蛋白催化的RNA合成。结果显示,正链RNA在体外不能指导RNA合成,而负链RNA模板可以产生一条全长的正链RNA产物,表明NS5B对负链RNA具有模板特异性。NS5B对负链RNA的特异性在模板竞争性实验中得到进一步证实,正链RNA的存在和竞争对以负链为模板的RNA合成没有影响。这样,就合理解释了在HCVRNA复制时正链RNA的数量远比负链RNA多这一问题。同时,本实验的结果也为进一步研究病毒或其它细胞因子参与以正链RNA为模板进行的RNA合成,以及有关负链RNA模板特性的研究奠定了基础。     

NS5B与HCV负链RNA 3＇末端特异性结合的分析

NS5B是RNA依赖性RNA聚合酶,在病毒RNA合成过程中起到中心催化酶的作用.在大肠杆菌中表达和提纯了GST-NS5B融合蛋白,应用紫外交联试验(UVcross-linking)检测NS5B与丙型肝炎病毒(HCV)负链RNA3＇末端的结合,确定NS5B是否参与HCV负链RNA3＇末端复制体的形成.NS5B可与HCV负链RNA3＇末端发生结合,这种结合存在量效关系,比与正链RNA3＇UTRX区的结合强约10倍,超大量的非同源性RNA和蛋白质不能竞争抑制NS5B与负链RNA3＇末端的结合,证明这种结合存在特异性.结果提示NS5B是HCV负链RNA3＇末端复制体的成分之一.     

NS5B与HCV负链RNA 3′末端特异性结合的分析

NS5B是RNA依赖性RNA聚合酶，在病毒RNA合成过程中起到中心催化酶的作用，在肠杆菌中表达和提纯了GST－NS5B融合蛋白，应用紫外交联试验（UV cross-linking）检测NS5B与丙型肝炎病毒（HCV）负链RNA3′末端的结合，确定NS5B是否参与HCV负链与HCN负链RNA3′末端复制体的形成。NS5B可与HCV负链RNA3′末端发生结合，这种结合存在量效关系， 比与正链RNA3′UTR X区的结合强约10倍，超大量的非同源性RNA和蛋白质不能竞争抑制S5B与负链RNA3′末端的结合，证明这种结合存在特异性。结果提示NS5B是HCV负链RNA3′末端复制体的成分之一。     

重组西尼罗病毒NS5融合蛋白依赖RNA的RNA聚合酶特性鉴定

西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)非结构蛋白NS5是病毒基因组复制的关键蛋白.以病毒全长cDNA克隆为模板,PCR扩增获得NS5的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性区（NS5pol）及该蛋白完整的编码序列（NS5F）,分别克隆于原核表达载体pET-28a 并转化至大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中诱导表达.表达的可溶性重组蛋白经Ni柱亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western印迹鉴定.结果显示,二者均为病毒特异蛋白,且纯度均在90%以上.进一步的体外RdRp分析及EMSA的结果表明,NS5pol和NSF5均有较高的RdRp活性,且该活性具有RNA模板序列和二级结构的特异性.获得的具有RdRp活性的NS5pol和NS5F为西尼罗病毒基因组复制相关元件的研究奠定了基础.     

丙型肝炎病毒的非结构蛋白3抑制剂

丙型肝炎严重威胁人类健康,非结构蛋白3（NS3）在丙型肝炎病毒（HCV）多聚蛋白水解过程中起重要作用,被公认为治疗丙型肝炎的有效药物靶标。该文介绍目前国内外有关NS3蛋白酶抑制剂（包括寡肽类抑制剂和非肽小分子抑制剂）的研究进展。     

四环素诱导的丙型肝炎病毒非结构蛋白5B稳定细胞株的构建和检测

丙型肝炎病毒(HCV)感染个体后在宿主细胞内长时间保持低水平复制,与慢性肝炎、肝硬化及肝细胞肝癌的发生密切相关.目前,HCV感染后肝细胞发生转化的具体机制还不清楚.非结构蛋白5B(NS5B)是HCV编码的非结构蛋白之一,具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(RdRp),是病毒复制所需的关键酶.除参与病毒复制外,NS5B通过...     

RNA依赖的RNA聚合酶的结构特征及其靶向抑制剂的开发

新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染导致的急性呼吸道传染性疾病。自2019年爆发以来，SARS-CoV-2在世界范围内引起大流行，严重威胁人类的生命安全。目前，已有的疫苗尚不能提供完全的机体免疫保护。因此，开发广谱有效的抗病毒抑制剂是当下热门的研究方向。SARS-CoV-2属于RNA病毒，其RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)在不同RNA病毒中具有高度保守性，是抗病毒抑制剂研发的重要靶标。RdRp是RNA病毒复制的核心组成部分，具有典型的右手杯状结构特征。本文重点介绍近年爆发并持续流行的新型冠状病毒RdRp的结构特征，以及靶向抑制剂的研发进展。同时，选取了其它几种有代表性的致病RNA病毒：流感病毒、轮状病毒、人类鼻病毒、丙型肝炎病毒和寨卡病毒，介绍了它们RdRp的结构特征及其靶向抑制剂的开发。本研究比较了抑制剂靶点结构的异同及抑制效果差异，并分析了可能导致该差异的原因。最后，本文总结讨论了目前针对RdRp...     

嵌合型HCV全长cDNA的构建及体外转录制备感染性RNA的研究

构建HCV la/1b嵌合型全长cDNA克隆,进行体外转录,脂质体法转染HepG2细胞,以RT-PCR法检测HCV正、负链RNA,Western印迹检测HCV蛋白表达.结果表明,细胞在转染后8代(约35d)内,能间断检测到HCV正、负链RNA以及相对分子质量约70000的HCV NS3蛋白,证明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达.本研究表明含有该嵌合型全长cDNA的质粒可以为后续HCV的研究提供大量可重复的性质均一的病毒模板,有助于深入了解HCV的复制机制.