甘蓝型油菜Fad2基因的RNA干扰及无筛选标记高油酸含量转基因油菜新种质的获得

利用已获得的油莱种子贮存蛋白——十字花科蛋白（cruciferin）基因的启动子和终止子,构建了无选择标记基因且同时具有正义及反义结构的油酰去饱和酶基因（Fad2）种子特异表达RNAi载体,并通过农杆菌介导的转化,获得了只含有油菜原有基因且Fad2基因表达受抑制的转基因植株。RT—PCR分析结果表明,在油酸含量达到83.9％的转基因植株中未检测到在非转基因植株中普遍存在的Fad2基因转录mRNA——一种典型的RNA干扰现象。通过对植株生长发育状态的观察比较,该高油酸含量转基因株系并未表现出双突变体中由于Fad2基因的失活所引起的植株抗寒能力差、发育迟缓、花蕾死亡、结实率低等不利农艺学性状。     

甘蓝型油菜TT1基因反义植物表达载体的构建

拟南芥TT1(transparenttesta1)基因编码一个WIP类型锌指蛋白转录因子,调控内种皮发育和原花青素在内种皮的积累。本研究通过PCR扩增了甘蓝型油菜(Brassicanapus)TT1基因家族(BnTT1)的一段特异保守片段TT1A,并将其亚克隆到中间载体pCambia2301G中,构建了TT1反义植物表达载体pCambia2301G-TT1A,通过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株。此表达载体的构建为进一步研究TT1基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理和利用反义TT1基因遗传转化获得转基因新型黄籽油菜奠定了基础。     

甘蓝型油菜油酸配合力的双标图分析

用GGE双标图法对甘蓝型油菜8×8完全双列杂交试验的脂肪酸组分进行分析,以期得到配合力高的亲本,为高油酸材料的转育和配组奠定基础。结果显示:(1)一般配合力(GCA)较高的亲本是父本Y511、Y539和母本Y511、Y520、Y539,而特殊配合力(SCA)较高的亲本是父本L308、Y511、Y539和母本L121、L307、L331、Y539。从GCA和SCA综合来看,Y511、Y520和Y539是配合力较高的父本,L307、L331、Y539是配合力较高的母本,父本L121和母本L308的配合力相对最低;(2)Y539是母本L121、L307、L308、L332、Y511、Y520、Y539的最佳组配父本,Y511是L331的最佳组配父本;Y520是父本L121、L307、L331、L332、Y511的最佳组配母本,Y539是L308、Y520、Y539的最佳组配母本;(3)SCA较高的组合有L307×L308、L331×L332、L332×Y511、Y520×Y511、Y539×L121等;(4)在芥酸含量为0、二十碳烯酸含量趋近于0(0.87%左右)、硬脂酸含量变幅不大(1.36%~1.75%)的遗传背景下,父本脂肪酸组分中油酸与棕榈酸、硬脂酸、亚油酸和亚麻酸均呈负相关;母本中油酸与硬脂酸呈正相关,与棕榈酸、亚油酸、亚麻酸呈负相关;(5)各杂交种脂肪酸组分的表型关系中,与油酸含量呈正相关的是硬脂酸,呈负相关的是棕榈酸,而与亚油酸、亚麻酸呈极显著负相关,这与母本脂肪酸组分之间的关系基本一致。     

甘蓝型油菜线粒体功能未知基因 ORF 117的载体构建与转化

本研究克隆了甘蓝型油菜线粒体功能未知基因 ORF 117,构建了带有线粒体转运信号肽序列（TP ）的植物过表达载体35S ∷TP-ORF117、35S ∷TP-EGFP 和35S ∷TP-ORF117-EGFP ,转化野生型拟南芥并进行抗除草剂筛选,共获得纯合的转基因拟南芥株系62个。qPCR 表明,ORF 117在转基因材料中得到高效过表达。用转35S ∷TP-EGFP 、35S ∷TP-ORF117-EGFP 拟南芥制备原生质体,经线粒体特异染料染色,在激光共聚焦显微镜下做线粒体、GFP 共定位检测,GFP 蛋白和 ORF117-EGFP 融合蛋白被准确定位到了线粒体。     

甘蓝型油菜BnaLPAT2基因克隆与生物信息学分析及载体构建

为进一步研究甘蓝型油菜BnaLPAT2基因,通过TAIR网站查找拟南芥AtLPAT2 (AT3G57650),在Brassica Database数据库检索到4条甘蓝型油菜LPAT2序列,据此设计引物,通过RT-PCR合成c DNA,得到4条CDS序列,其大小依次为1 173 bp、1 167 bp、1 173 bp、1 155 bp,分别命名为BnaLPAT2-1～BnaLPAT2-4。4个BnaLPAT2蛋白通过生物信息学预测分析显示:BnaLPAT2编码的氨基酸在384～390之间,理论分子量介于43 226.59～43 730.17 Da之间。甘蓝型油菜LPAT2蛋白的二级结构和跨膜区大致相同,均由LPLAT superfamily、PlsC superfamily、Acyltransf_C superfamily结构域组成,且具有较近的亲缘关系。从基因结构发现:4个BnaLPAT2均含有相同的外显子和内含子数,分别位于C08、A09、A07和A04染色体上。分析表明,克隆获得的4个甘蓝型油菜BnaLPAT2为该基因家族成员。为进一步研究甘蓝型油菜LPAT2基因的功能,我们通过双酶切技术,构建pBI121-LPAT2-napin载体,并转化根癌农杆菌GV3101。     

甘蓝型油菜γ-TMT基因的克隆及其植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了甘蓝型油菜γ-TMT基因,并将其克隆到pMD18-T vector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明,克隆片段全长为1 044 bp.将甘蓝型油菜γ-TMT基因定向克隆到植物表达载体pCambia1300的35S启动子下游,构建了该基因的植物超表达载体.     

甘蓝型油菜几丁质酶基因BnCHB4环境信号响应分析

为了揭示植物激素及环境胁迫对甘蓝型油菜(Brassica napus)几丁质酶基因(BnCHB4)表达的影响。用化学物质苯丙噻重氮(BTH)、甲基茉莉酸(MeJA)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)以及核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和机械伤害分别处理油菜品种中双9号,采用荧光定量PCR方法测定BnCHB4在各诱导或处理后的相对表达量,结果表明,BTH、MeJA、ACC、S.sclerotiorum和机械伤害都能够快速诱导该基因的表达。表明,BnCHB4是各种环境信号的响应基因。     

甘蓝型油菜BnTTG1-1基因的功能分析

拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtTTG1作为WD40重复转录因子存在于细胞核中,对表皮毛形成、花青素合成和储藏物质积累等具有重要调节作用。该研究从甘蓝型油菜(Brassica napus)品种秦优7号中克隆获得了BnTTG1-1基因的全长CDS序列,对其进行了烟草(Nicotiana benthamiana)叶片细胞的亚细胞定位研究,检测了BnTTG1-1在油菜(B.campestris)中的时空表达模式,并比较分析了BnTTG1-1对多个生物学过程的影响作用。结果表明,BnTTG1-1定位于烟草叶片细胞的细胞核中,推测其作为转录因子发挥调节作用。BnTTG1-1广泛存在于油菜营养组织和发育的种子中。在突变体ttg1-13背景下,异源表达BnTTG1-1基因能够完全恢复该突变体的多个表型,如无表皮毛形成和花青素合成、种皮呈黄色、种子脂肪酸和储藏蛋白含量高以及在种子萌发和幼苗形态建成过程中对高葡萄糖和高盐胁迫耐受力差等。由此可知,甘蓝型油菜BnTTG1-1与拟南芥AtTTG1在植物生长发育的多个生物学过程中具有类似的功能。     

BnFAD2、BnFAD3和BnFATB基因的共干扰对油菜种子脂肪酸组分的影响

甘蓝型油菜是一种重要的油料作物,为了改良其种子脂肪酸组分,提升其经济价值,本研究分析了油菜种子发育时期脂肪酸合成积累模式及BnFAD2、BnFAD3、BnFATB基因的表达规律,认为这3个基因在种子发育中后期(授粉后25d起)的高效表达对油酸合成积累有着重要影响。通过Napin启动子诱导对油菜植株中BnFAD2、BnFAD3、BnFATB基因进行RNAi共干扰抑制,以达到提升油酸含量的目的。试验结果表明,转基因油菜种子中BnFAD2、BnFAD3、BnFATB基因的表达受到强烈抑制,种子中油酸含量由66.76%提升至82.98%,且油脂合成的相关基因同步出现表达上调。     

油菜BnCr4基因RNAi载体构建及植株转化

该实验构建了含甘蓝型油菜黄化相关基因BnCr4特异片段反向重复结构的RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Cr4,通过根癌农杆菌介导转化油菜,获得47株抗Basta的抗性再生油菜植株,其中10株经PCR鉴定为阳性转基因植株.随机选取3株经鉴定的转基因阳性油菜植株进行半定量RT-PCR分析,结果显示,相对于非转基因的野生型油菜,3株转基因植株中BnCr4基因的表达量分别降低了78.5%、8.5%、11.8%,表明该干扰载体转入油菜能特异引起植株BnCr4基因表达量下降.     

芸薹属类黄酮3'-羟化酶基因家族RNA干扰载体的构建

目的：构建芸薹属类黄酮3′羟化酶（F3′H）基因家族的RNAi载体。方法：采用PCR克隆了607bp的芸薹属F3’H基因家族的RNAi片段,将其反义片段、正义片段分别采用NcoⅠ＋AatⅡ、BamHⅠ＋XbaⅠ插入到改进型植物RNAi基础载体pF-GC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成11366bp的重组载体pFGC5941M-BF3′HI（简称为pBF3′HI）,复合PCR鉴定后转化根癌农杆菌,获得工程菌株。结果：载体构建成功。结论：构建了RNAi载体pBF3′HI,可用于芸薹属植物花色、种皮色泽、茎叶色彩等性状的机理研究和遗传修饰。     

小麦Vp-1基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

小麦成熟期穗发芽是世界性的自然灾害,严重影响小麦的产量和品质.Viviparous-1(Vp-1)是促进胚成熟和休眠的主要转录调节因子,与小麦穗发芽抗性有着密切的关系.本实验根据小麦Vp-1基因序列,以植物表达载体pAHC25为基础,成功构建了含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WVpRi.采用基因枪法轰击小麦品种新春9号幼胚材料1825个,共获得34株T0再生植株.利用Bar基因引物和干扰片段特异引物对再生植株进行PCR检测,获得Bar基因和干扰片段均为阳性的植株3株,转化率为0.16%.本研究为深入分析Vp-1基因功能,进而通过分子育种进行小麦穗发芽抗性的遗传改良提供了科学依据.     

砂梨脂氧合酶cDNA片段克隆与RNAi载体构建

以砂梨‘若光’的成熟果实为材料,根据脂氧合酶氨基酸保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR克隆到1段长827 bp的序列,经Blast比对和DNAstar软件聚类分析,结果表明由该序列推导出的氨基酸序列含有脂氧合酶氨基酸保守结构域,与马铃薯脂氧合酶基因的氨基酸序列相似性达到77.5%,判断其为砂梨脂氧合酶基因片段,命名为LOX1,并将序列登录到GenBank,登录号为EF215448。根据RNAi载体的构建原则,选择LOX1一开放阅读框设计携带酶切位点的特异引物,通过PCR扩增正、反向基因片段,再与YYT间隔区串连,插入植物表达载体pYF7713中的相应位置,成功地构建了干扰LOX基因表达的RNAi的植物双元表达载体pYL028,为深入研究该基因在砂梨果实成熟过程中的功能及耐贮藏基因工程育种奠定了基础。     

AtAAPT1基因RNAi的植物表达载体的构建

以拟南芥中氨基乙醇磷酸转移酶基因AAPT1作为RNA i的靶向序列,采用RT-PCR的方法获得目的DNA片段。然后以pBS-T-AAPT1载体为基础,构建了由35 s启动子调控的AAPT1基因RNA i的植物表达载体pART27-AAPT1(1,2),并通过电击法将重组质粒导入根癌农杆菌C58中。AtAAPT1基因RNA i的植物表达载体的构建对于研究AAPT1基因的功能和应用具有重要的理论价值。     

棉蚜Catb5基因RNAi载体的构建及其对烟草的转化

依据细胞色素氧化酶亚基Ⅰ序列的多态性设计特异性引物,通过PCR技术扩增出的特异性条带鉴定为棉蚜。提取棉蚜总RNA,利用RT-PCR技术从棉蚜中扩增出大小为515 bp的Catb5目的基因,进一步将两段Catb5基因分别正向和反向连接到植物表达载体pBi35SG12上,构建了pBi35SC5 RNAi表达载体,并通过农杆菌介导法导入烟草中,PCR检测表明已得到转基因烟草再生苗。     

甘蓝型油菜的遗传转化

甘蓝型油菜的各种外植体经遗传转化、组织培养后可以再生为转基因植株,但再生频率会因外植体的基因型、年龄、培养基添加成分和农杆菌共培养的不同而发生变化。转化方法包括农杆菌介导转化、基因枪法、花粉介导法、PEG介导法等,其应用前景非常广阔。甘蓝型油菜的遗传转化在其品质改良、抗逆性提高、雄性不育系的获得和一些特殊性状方面都取得了很大成就。简要介绍甘蓝型油菜的再生体系建立、转化方法及所取得的部分成就。     

p21RNAi的pSUPER载体的构建及功能鉴定

目的：构建抑制p21基因表达的pSUPERRNAi载体（pSUPER—p21）并鉴定其功能。方法：化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向大鼠p21基因的寡核苷酸链,各60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒（pSUPER-p21）。通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果。将正确构建的质粒转染大鼠原代培养皮质神经元,western blotting检测经红藻氨酸处理的神经元中p21蛋白表达。结果：pSUPER-p21载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。Western blotting结果证实pSUPER-p21载体可特异性抑制红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元中p21蛋白表达的上调。结论：靶向p21的pSUPERRNAi载体构建成功,该载体可特异性抑制p21基因表达。     

马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

RNA沉默(RNAi)介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略.马铃薯Y病毒(PVY)在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害,并且造成严重的经济损失.本文以PW的外壳蛋白(CP)基因为模板扩增300 bp和354 bp两个片段,正向和反向分别插入植物表达载体pROKⅡ的35S启动子下游,从而构建了以PVY的CP基因为靶标的RNAi植物表达载体pROKY300,转入农杆菌EHA105中,以农杆菌渗入法在本氏烟中瞬时表达与PVY CP同源的hairpin RNA.结果表明,瞬时表达的hairpinRNA有效干涉了PVY侵染.