小鼠Lbh抗体的制备和鉴定

利用小鼠作为模式动物进一步研究人类Lbh（Limb—bud—and—heart）在心脏发育中的功能。提取正常成年小鼠的心脏总RNA,RT—PCR扩增小鼠Lbh的全长开放阅读框,构建原核表达重组质粒pGEX4T-1-Lbh。转化大肠杆菌BL21后,摇菌培养到OD600为0．5～0．6时,加IPTG诱导融合蛋白的表达。将纯化的GST—Lbh融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。免疫印迹法检测表明该抗体有较好的特异性,可用于该基因结构和功能的研究。     

人Hepassocin的原核可溶性表达与纯化

目的：构建人Hepassocin的原核表达载体,可溶性表达并纯化得到高纯度的重组人Hepassocino方法：将人Hepassocin基因克隆到原核表达载体pET40b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,于28℃经0．1mmol／LIPTG诱导6h,表达Ds-bC-Hepassocin融合蛋白,经镍柱纯化可溶性融合蛋白,用肠激酶切除融合蛋白的DsbC-His标签,再用镍柱纯化分离酶切后的Hepassocin,通过超滤进一步纯化并浓缩,用Western blot验证纯化后的Hepassocin。结果：构建了pET40b-Hepassocin原核表达载体,经诱导表达、亲和层析和肠激酶切除融合标签,获得了相对分子质量约32000的可溶性高纯度蛋白,Western blot鉴定证实该蛋白为不含融合标签的重组人Hepassocin。结论：实现了人Hepassocin的原核可溶性表达,通过纯化获得了较高纯度的重组人Hepassocin,为制备其单克隆抗体,进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人前列腺特异膜抗原膜外区基因的克隆表达及抗体的制备

利用RT PCR技术 ,从前列腺癌组织总RNA中扩增人前列腺特异膜抗原 (PSMA)基因编码区序列 ,克隆至pcDNA3.1载体 ,以此为模板再次PCR扩增出PSMA膜外区cDNA(edPSMA) ,序列测定表明克隆获得的PSMA及edPSMA与基因库所登录的序列相一致。构建原核表达质粒pMAL c2x edPSMA ,经IPTG诱导表达的MBP edPSMA融合蛋白分子量约 12 0kD ,Westernblot证实表达产物可特异地与PSMA单克隆抗体 4G5结合。用直链淀粉琼脂糖凝胶 (Amyloseresin)亲和层析纯化蛋白质可得到电泳均一的融合蛋白 ,免疫BALB C小鼠制备多抗 ,获得效价为 1∶12 80 0的多克隆抗体 ,该抗体可用于前列腺癌组织标本PSMA表达的检测     

人FBXO31蛋白的原核表达及抗体制备

FBXO31位于人染色人体16q24.3,是一个乳腺癌候选抑癌基因。为了获得抗FBXO31的多克隆抗体,构建了FBXO31基因的原核表达质粒pET-28a-FBXO31。将原核表达质粒pET-28a-FBXO31转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,IPTG诱导表达融合蛋白。融合蛋白主要以包涵体形式存在,常规方法纯化包涵体。将纯化的pET-28a-FBXO31融合蛋白用于免疫新西兰大白兔获得抗血清,用pET-28a-FBXO31对抗血清进行分离纯化,得到抗FBXO31多克隆抗体。用Western印迹和免疫沉淀对其进行初步鉴定。获得了兔抗人FBXO31的多克隆抗体,为进一步研究FBXO31的生物功能提供了有用的工具。     

人血红素加氧酶-1的原核表达、纯化及其中和抗体的制备

目的确定人血红素加氧酶-1（human heme oxygenase-1,hHO-1）在大肠埃希菌中的表达条件与纯化方法,利用纯化的蛋白制备具有中和活性的hHO—1多克隆抗体。方法将hHO-1原核表达质粒pMW172／hHO-1转人大肠埃希菌菌株BL21,通过改变摇床转速、诱导剂IPTG浓度和培养时间确定hHO-1蛋白的最佳可溶性表达条件;利用超声破碎、高速离心、分级盐析、分子筛层析等方法纯化hHO-1蛋白,建立体外HO-1活性测定方法检测hHO-1蛋白的活性;利用纯化的hHO-1活性蛋白作为抗原免疫新西兰兔,制备多克隆抗体;利用ELISA方法和Western印迹技术分别测定抗体的效价和特异性,通过HO-1活性测定检测抗体的中和活性。结果确定hHO-1最佳可溶性表达条件为：37℃、200r／min培养3h后,0．1 mmoL／LIPTG诱导培养4h。超声破碎菌体,上清经30％～40％盐析纯化及分子筛层析纯化,获得活性hHO-1蛋白,收得率为30．3％,纯化倍数为2．83倍,纯度为90％。制备的抗hHO-1的兔血清效价达到10^6,并能中和掉46％hHO-1的催化活性。结论为hHO-1蛋白的表达和纯化以及多克隆抗体制备确立了可行的技术方案;获得了高纯度活性hHO-1蛋白及hHO-1多克隆抗体,为HO-1功能、结构研究,以及相关疾病研究奠定了基础。     

人copineV蛋白多克隆抗体的制备

目的：制备兔抗人copineV多克隆抗体。方法：将copineV N端423bp（626-1048bp）构建到原核表达载体pET28a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家免3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用（NH4）2SO4沉淀法初步纯化抗体。结果：表达并纯化了copineV N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copineV。结论：制备了具有高亲和性和特异性的抗人copineV多克隆抗体。     

Hus1(Hus1f)基因可溶性表达、蛋白纯化及抗体制备

为进一步了解Hus1蛋白在细胞周期检查点信号传导通路中的功能 ,用RT PCR技术从NIH3T3细胞的总RNA中扩增出Hus1基因片段Hus1f(6 0 6～ 84 6bp) ,使其在大肠杆菌中呈可溶性表达 .用镍离子螯合柱 (Ni NTA)纯化Hus1f蛋白 ,获得纯度较高的蛋白 .用纯蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体 .ELISA结果显示效价达到 1∶6 40 0 .Western印迹结果表明 ,该抗体可以与Hus1蛋白特异结合 .通过免疫共沉淀实验发现 ,Hus1蛋白与Chk1蛋白之间存在相互作用 ,为进行信号转导通路的研究奠定了基础 .     

转录因子hB1F的融合表达及抗体制备

通过酵母单杂交系统从成人肝库中克隆到转录因子,即人Ｂ１结合因子（ｈＢ１Ｆ）。ｈＢ１Ｆ是核受体超家族的一个新成员。将ｈＢ１Ｆ的ｃＤＮＡ片段（ｎｔ４５０－９３０）克隆到表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,得到可溶性的蛋白质产物。免疫小鼠获得多克隆抗体,经ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ反向亲和纯化后,表现出较好的针对ｈＢ１Ｆ的专一性,可以用于对ｈＢ１Ｆ的进一步的结构和功能的研究。     

人端粒结合蛋白TRF1的克隆、表达和抗体制备

利用RT-PCR技术,从HeLa细胞的cDNA文库中扩增到人端粒结合蛋白1(hTRF1)基因编码区序列,克隆至pUCm-T载体,测序正确后,构建带His₆-tag原核表达载体pET-28c-TRF1,经IPTG诱导表达的His₆-TRF1融合蛋白分子量约为65kD,Western-blot证实表达产物可特异地与TRF1抗体sc-6165结合。用Ni^2＋NTA胶亲和层析纯化可得到电泳均一的融合蛋白,免疫新西兰纯种大白兔,获得特异性好的多克隆抗体,该抗体可用于免疫荧光染色和Western-blot方法检测哺乳动物细胞内源性的TRF1分子。     

奥利亚罗非鱼DMRT1和DMRT4抗体制备及组织表达谱分析

DMRT1和DMRT4是DMRT基因家族的成员,该家族成员与果蝇的性别决定基因和线虫性别决定基因一样,所编码的蛋白质都包含一个具有DNA结合能力的保守基序,即DM结构域,并以锌指结构与特异DNA序列相结合,在性别决定和分化发育中起调控作用。采用RT-PCR方法分别从奥利亚罗非鱼卵巢和精巢中扩增克隆出DMRT1和DMRT4全长cDNA片段,构建表达载体,在大肠杆菌中表达了BMP-DMRT4和BMP-DMRT1蛋白。经Xa切割、Amylose-sepharose柱层析纯化后作为抗原免疫新西兰白兔制备了DMRT1和DMRT4多克隆抗体,并进行纯化。对纯化多抗进行Western blot分析,结果表明获得了高特异性的DMRT1和DMRT4抗体。为了观察DMRT1和DMRT4在组织中的表达谱,首先,我们通过实时荧光定量RT-PCR检测雌雄奥利亚罗非鱼多种组织mRNA的表达,仅在卵巢和脑中检测到DMRT4,在精巢中检测到DMRT1;其次,制备了多种组织匀浆蛋白,使用纯化的抗体进行Western blot分析,仅分别在卵巢和精巢中检测到DMRT4和DMRT1蛋白的表达;制备多种奥利亚罗非鱼组织切片,使用纯化的DMRT4和DMRT1多抗进行免疫组织化学分析,发现DMRT4仅在卵巢表达,而DMRT1仅在精巢表达。这些结果有助于阐明DMRT4和DMRT1的功能及在鱼类性别调控中的作用。     

兔抗人热激蛋白70样蛋白1多克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：制备兔抗人热激蛋白70样蛋白1（HSP70L1）的多克隆抗体并进行初步鉴定。方法：在大肠杆菌中重组表达融合蛋白GST-HSP70L1和His-HSP70L1并纯化;将GST-HSP70L1融合蛋白用于免疫新西兰大耳白兔获得多克隆抗体,用His-HSP70L1对抗血清进行分离纯化,得到抗HSP70L1多克隆抗体,用Western印迹、免疫沉淀对其进行初步鉴定。结果：获得了高表达的GST-HSP70L1和His-HSP70L1重组融合蛋白;纯化获得抗HSP70L1抗体,此抗体可用于Western印迹和免疫沉淀实验。结论：获得了兔抗人HSP70L1的多克隆抗体,为进一步研究HSP70L1的生物功能提供了有用的工具。     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。     

Y盒结合蛋白1单克隆抗体的研制、表位测定及其免疫学应用

建立稳定分泌抗人Y盒结合蛋白1单克隆抗体(anti-YB-1 mAb)的杂交瘤细胞株,鉴定其表位与免疫学应用。将重组YB-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA法筛选鉴定、定株后采用腹水诱生法制备anti-YB-1 mAb;Protein G亲和层析法纯化mAb,ELISA法测定mAb效价、亚型及相对亲和力。采用抗原表位预测法鉴定anti-YB-1 mAb识别表位所在区域。Western blot和免疫组化鉴定mAb识别内源性YB-1的特异性。经筛选鉴定获得2株稳定分泌anti-YB-1 mAb的杂交瘤细胞(1-D9,3-E8);腹水抗体效价均≥1×10-6,亚型均为IgGl;1-D9和3-E8单抗识别表位分别位于(134-160aa)与(266-303aa)肽段。Western blot、免疫组化结果证实anti-YB-1 mAb能特异性识别内源性YB-1。该研究为YB-1免疫学定性、定量检测方法的建立、肿瘤靶向抗体治疗及进一步探讨YB-1的生物学功能奠定了基础。     

重组人纤溶酶原Kringle1-5的制备及其

为了研究重组人纤溶酶原 Kringle1-5(K1-5)的抗血管生成活性及其对内皮细胞增殖的影响, 通过PCR扩增人纤溶酶原K1-5 cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pET-K1-5, 转化E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达,SDS-PAGE 和Western 杂交检测K1-5的表达。鸡胚尿囊膜 (CAM) 实验和MTT实验分别检测重组人纤溶酶原Kringle1-5对鸡胚新生血管生成和内皮细胞的抑制作用。结果表明,IPTG诱导原核表达载体pET-K1-5在E.coli BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的32%, K1-5主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、溶解、Ni-spin 亲合柱层析纯化以及蛋白质复性等步骤后,获得了纯度约为96%的重组K1-5蛋白。CAM实验表明,原核表达的重组人K1-5能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成。MTT实验结果显示,重组人K1-5特异地抑制内皮细胞的增殖, 而对非内皮细胞无抑制作用。     

Soluble programmed death-1 (sPD-1) and programmed death ligand 1 (sPD-L1) as potential biomarkers for the diagnosis and prognosis of glioma patients

BackgroundThis study aimed at investigating the feasibility of testing for soluble programmed death-1 (sPD-1) and soluble programmed death ligand 1 (sPD-L1) in serum samples of glioma patients and to evaluate the diagnostic and prognostic value of these two soluble molecules.MethodsSerum samples collected from 70 glioma patients before surgery were designated as the pre-operative (Pre) group, samples obtained from 90 post-surgery glioblastoma patients were designated as the Post group, and samples from 20 healthy volunteers were used as controls. Peripheral blood sPD-1 and sPD-L1 levels were detected by using ELISA kits and compared among the groups. The associations of these soluble molecule levels with clinicopathological variables and tumour progression were investigated.ResultsAmong the three groups, the Pre group had the highest sPD-1 levels, whereas the median sPD-L1 level was significantly lower in the Post group than in the other two groups. The area under the curve (AUC) of sPD-1 (0.762) for diagnosis was similar to that of sPD-L1 (0.718). Higher serum levels of sPD-1 and sPD-L1 were present in samples of patients with more advanced brain tumours. Kaplan-Meier analysis showed that higher serum levels of sPD-1 (>11.14 pg/mL) and sPD-L1 (>63.03 pg/mL) might predict shorter progression-free survival times of glioma patients.ConclusionsThis study showed that sPD-1 and sPD-L1 might be promising predictive biomarkers for the diagnosis and prognosis of glioma patients.     

免疫检查点程序性细胞死亡蛋白配体-1翻译后修饰及其在免疫治疗中的应用前景

免疫检查点程序性细胞死亡蛋白配体-1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)是一种主要表达于肿瘤细胞表面的免疫抑制性分子,其可与T淋巴细胞表面的程序性细胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein 1,PD-1)结合,抑制T淋巴细胞的激活,发挥免疫抑...     

抗人PAI—1单克隆抗体制备,鉴定和应用

以重组PAI-(rPAI-1)为抗原,通过杂交瘤技术获得6株阳性杂交瘤细胞(AP1、AP2、AP3、AP4、AP5和AP6),并用SPA亲和层析纯化了抗PAI-1单克隆抗体(McAb)。所有McAb均能识别rPAI和天然PAI-1,腹水滴度均为10~6以上。6种McAb对PAI-1亲和常数在3.45×10~7—1.05×10~9mol/L之间。AP2、AP3 McAb能完全抑制PAI-1活性,AP4、AP和AP6只能部分抑制PAI-1活性,AP1则不抑制PAI-1活性。6种McAb中只有AP1、AP4和AP5能识别PAI-1/t-PA复合物。利用AP1、AP3、和AP4 McAb制备免疫亲和柱一步纯化HepG_2细胞分泌的PAI-1,纯度大于98％,回收率92％,纯化倍数51倍。利用抗PAI-1 McAb建立了夹心法ELISA,测定了人血浆PAI-1水平,正常人血浆PAI-1平均含量(±D)为24.7±7.75ng/ml。     

重组人GM－CSF／MCAF融合蛋白抗血清的制备与鉴定

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）融合蛋白经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５和ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ两步柱层析,获得了电泳纯的ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ融合蛋白。为进一步研究其结构与功能,我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。ＤｏｔＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验表明,该抗血清效价高、特异性好,可分别与ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ、ＧＭ－ＣＳＦ和ＭＣＡＦ发生反应。     

重组人GM－CSF／MCAF融合蛋白抗血清的制备与鉴定

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）融合蛋白经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５和ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ两步柱层析,获得了电泳纯的ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ融合蛋白。为进一步研究其结构与功能,我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。ＤｏｔＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验表明,该抗血清效价高、特异性好,可分别与ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ、ＧＭ－ＣＳＦ和ＭＣＡＦ发生反应。