超慢生大豆根瘤菌DNA G+C含量和DNA同源性测定

用热变性温度法和液相复性速率法分别测定了超慢生大豆根瘤菌(ESG,extra-slow-growing soybean rhizobia)DNA G+C mol%及与其它根瘤菌间的DNA同源性.结果表明,ESG的DNA G+C mol含量在59.2—63.5%之间,且不同地区不同血清型的ESG代表菌株DNA同源率在70%以上,说明它们是遗传型一致的类群.ESG与在大豆上结瘤的快生大豆根瘤菌(Rhizobium fredii USDA205)同源率为14.8%,与慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)三个DNA同源组的同源率分别为20.5%,30.0%,19.4%.测定结果还表明,ESG与其它根瘤菌遗传学的亲缘关系也很远.     

超慢生大豆根瘤菌2062菌株的部分16SrRNA序列测定

采用ＰＣＲ（聚合酶链式反应）的方法扩增并克隆了超慢生大豆根瘤菌（ＥＳＧ,ｅｘｔｒａ－ｓｌｏｗｌｙ－ｇｒｏｗｉｎｇ ｓｏｙｂｅｎ ｒｈｉｚｏｂｉａ）２０６２菌株的１６Ｓ ｒＲＮＡ的部分区段,然后进行核苷酸序列测定和分析。比较了测定的２６４个碱基序列与已经发表的其他相关根瘤菌序列的差异,并通过计算机遗传距离进行聚类分析。结果表明,ＥＳＧ与Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂ．ｅｌｋａｎ     

pH对土壤中土著快、慢生大豆根瘤菌结瘤的影响

1　引　　言土壤 ｐＨ对根瘤菌结瘤的影响一直是微生物学和微生物生态学研究的内容之一[4] .在对大豆根瘤菌的研究中 ,早期的研究主要集中于生长慢、产碱的大豆慢生根瘤菌 (Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ) [1,2 ] .1982年 ,Ｋｅｙｓｅｒ等[3] 报道了一类生长快、产酸的大豆根瘤菌 ,并命名为费氏中华根瘤菌 (Ｓｉｎｏｒｈｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉ ｉ) .由于它们在生理特性方面存在着明显的差异 ,其结瘤能力以及环境的生物、物理和化学等因素对结瘤的影响一直受到广泛的重视 .本文研究了偏酸、偏碱的 ｐＨ对费氏中华根瘤菌…     

超慢生大豆根瘤菌DNA G+C含量和DNA同源性测定

用热变性温度法和液相复性速率法分别测定了超慢生大豆根瘤菌(ESG,extra-slow-growing soybean rhizobia)DNA G+C mol%及与其它根瘤菌间的DNA同源性.结果表明,ESG的DNA G+C mol含量在59.2—63.5%之间,且不同地区不同血清型的ESG代表菌株DNA同源率在70%以上,说明它们是遗传型一致的类群.ESG与在大豆上结瘤的快生大豆根瘤菌(Rhizobium fredii USDA205)同源率为14.8%,与慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)三个DNA同源组的同源率分别为20.5%,30.0%,19.4%.测定结果还表明,ESG与其它根瘤菌遗传学的亲缘关系也很远.     

转座子Tn5诱变慢生大豆根瘤菌

用pSUP1011载体系统,Tn5诱变慢生大豆根瘤菌110、123,其KmR菌落出现频率为5x10-8一5x 10-7。Tn5的SmR。基因能在慢生大豆根瘤菌中表达。用卡那霉素加链霉素来筛选插入变株,可完全排除自然突变的干扰。从4450个KmR变株中检出营养缺陷型7株,其中His-(4)、Glu-(1)和Trp-(2),吸氢功能缺陷型10株,其中2株His-同时是吸氢缺陷(Hup-)和共生固氮缺陷(Nif-),其原养型回变体(回变频率为0.5×10-8)都同时恢复了吸氢与固氮功能,又失去了对卡那霉素的抗性。4株对氧特别敏感的Hup-缺陷型,在培养状态下无吸氢活性,但结瘤固氮时不放氢。     

快生型大豆根瘤菌基因库的构建

本文报道了用柯斯质粒(cosmid)pLAFRI 作为载体,通过 EcoRI 部分酶切快生型大豆根瘤菌的全部 DNA,获得“目的”DNA 片段,用大肠杆菌 ED8767作为受体菌株,我们构建了一株快生型大豆根瘤菌——B52菌株的基因库。插入的基因片段大小为20～30kb,所获得的抗性菌落数为3.9×10~4,其中外源基因插入频率为70%,重组子数超过“理论”值,达到了希望的建库要求。     

慢生大豆根瘤菌存在碱性磷酸酶的报告

利用磷饥饿的方法,在一株慢生大豆根瘤菌中发现可作为胞周蛋白标记酶的高活性碱性磷酸酶。该酶属诱导型,当磷酸盐浓度降至55μM时诱导已相当充分。培养物上清液中没有酶活。使用溶菌酶——EDTA和冷渗冲击的方法均没有提取出该酶。推测该酶可能与胞周空间外侧、外膜内侧的脂多糖结合。     

快生型大豆根瘤菌的渗透调节

弗雷德中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)RT 19是快生型大豆根瘤菌。该菌株在不同浓度NaCl条件下,其细胞内的游离谷氯酸和钾离子含量随盐浓度的提高而急剧增加。在无盐和低浓度NICl条件下,测不出细胞内有游离苏氨酸,但在较高浓度盐存在时,其含量也随着盐浓度的提高而递增。RT19在对数生长后期,突然加入NaCl,使其培养液中的NaCl的最终浓度达到300mmol／L,定时取样测定细胞内氨基酸含量,发现5分钟后谷氨酸含量急剧上升,比不加盐的对照高出5倍,而且在3小时内保持不变．苏氨酸也出现类似情况。测定了RT 19及其转化子RTt1 9和gTt50的谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)在盐压下的活性,发现在300 mmol／L NaCl或300mm。I／L KC1存在时,GDH酶活性稍为下降或不变,而GS和GOGAT酶活性则显著提高。     

单株根系来源的土著大豆慢生根瘤菌多样性

本文对由１株大豆根瘤分离、鉴定的１２个土著大豆慢生根瘤菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）菌株进行了种内多样性分析。在ＹＥＭ琼脂培养基上观察菌落大小不同（直径≥１０ｍｍ至≤０５ｍｍ）的菌株,有形成粘稠而半透明的Ｍ型菌落和稀薄而透明的Ｗ型菌落。以ＥＬＩＳＡ鉴定血清类型,分为ＬＬ１９血清族（包括Ｓｚ１１２ｓ）血清组和Ｓｚ１１９ｓ血清型及其他血清组）和非ＬＬ１９血清族（包括Ｓｚ１１３ｓ和Ｓｚ１２１ｓ两血清型及未知血清型）。以Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的ｐＭＪＳ１２为探针检测菌株染色体ＤＮＡ的ＥｃｏＲＩ消化产物的分子杂交谱,出现称为Ⅰ型的９６ｋｂ和Ⅱ型的６４ｋｂ两种类型的单一分子杂交带。ＨＰ５８９０Ａ气相色谱分析细胞脂肪酸,检出８种成分。其中,Ｃ１４∶１、Ｃ１８∶１和Ｃ１４∶０存在于所有供试菌株中,为不同于快生根瘤菌的３种主要成分,以此可将供试菌株分成６组不同菌株     

导入dctABD和parCBA／DE基因提高大豆慢生根瘤菌固氮皎效率和稳定？…

以ｐＬＡＦＲ３为载体构建重组质粒ｐＨＮ２０７,携带有来自苜蓿根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）的四碳二羧酸转移酶基因ｄｃｔＡＢＤ、来自ｐＴＲ１０２的ｐａｒＣＢＦＡ／ＤＥ基因和标记发光酶基因ｌｕｘＡＢ。利用２亲本杂交法,将重组质粒ｐＨＮ２０７导入大豆慢生根瘤菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＴＡ１１和ＣＢ１８０９,分别考察了转移接合子中外源重组质粒在人工培养条     

利用Tn5gusA5对大豆慢生根瘤菌lrp基因的诱变

通过对重组质粒ｐＧＸＮ３００中的 ２．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ片段测序分析发现,其上有一完整的ｌｒｐ基因和部分 ｐｕｔＡ基因,与 Ｋｉｎｇ ＮＤ等［１］报道的 Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ的ｌｒｐ基因ＤＮＡ序列有 ８８％同源性。利用 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５定位 诱变方法,对质粒ｐＧＸＮ３００进行插入诱变,得到２．３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ片段上有Ｔｎ５ｇｕｓＡ５插入位点的质粒ｐＧＸＮ３００－ Ｔ３８,将ｐＧＸＮ３００－Ｔ３８转移到大豆馒生根瘤苗（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＧＸ２０１中,得到的ＧＸ２０１转移接合子与不相容 质粒ｐＰＨ１ＪＩ发生同源双交换。通过抗性及ｇｕｓＡ活性检测,筛选到一ｌｒｐ基因突变株。Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析证 明这突变株的 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５插入确实是同源交换而不是转座产生,表明 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５ 诱变可以应用于大豆慢生根 瘤菌中的突变林筛选。     

我国南北大豆产区慢生大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育研究

利用16S rRNA基因RFLP、16S rRNA基因序列分析以及16S-23S rRNA IGS PCR RFLP技术对分离自我国南北大豆产区的慢生大豆根瘤菌进行了群体遗传多样性和系统发育研究。16S rRNA基因PCR RFLP分析以及16S rRNA基因序列分析结果表明:所有供试慢生大豆根瘤菌可分为B.japonicum和B.elkanii两个类群,其中属于B.japonicum的为优势种群,占供试菌株的91%,属于B.elkanii的仅占9%,多样性水平较低。16S-23S rRNA IGS PCRRFLP研究结果表明:属于B.japonicum的慢生根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,在69%的相似性水平上可分为群Ⅰ和群Ⅱ两大类群。群I的菌株以分离自黑龙江和河北等北部区域的菌株为代表,群Ⅱ的菌株以分离自广西和江苏等南部地域的菌株为代表,反映出明显的地域特征。两群菌株在系统发育上均与USDA6、USDA110和USDA122等B.japonicum的模式或代表菌株有差异。     

五株大豆根瘤菌噬菌体的普遍性转导

本文研究了5种烈性大豆根瘤菌噬菌体在大豆根瘤菌菌株间的普遍性转导。噬菌体psc和psx能在慢生大豆根瘤USDA110菌株间转导营养缺陷型标记和卡那霉素抗性标记。快生大豆根瘤菌MD3菌株间可通过噬菌体pfm转导营养缺陷标记和卡那霉素抗性标记。噬菌体pfc和pfx可在快生豇豆根瘤菌ANU240及其变种ANU265间转导抗性基因和定位于共生质粒（sym质粒）上的结瘤基因（common nod）。所有转导频率均在10-6~10-7之间。用紫外线处理噬菌体裂解液可以相应提高转导频率。     

接种不同大豆根瘤菌株的根瘤放氢和吸氢的研究

本实验测定和比较了七株大豆根瘤菌与三个大豆品种共生时的放氢和固氮效率。证明了大多数菌株接种不同寄主,其根瘤的放氢、吸氢和固氮效率的差异均明显。但USDA110在三个品种上所结根瘤不放氢或极少放氢;它的固氮量最高。根瘤的能量利用率与植株的氮积累及产量的相关性尚需进一步验证。     

我国主要生态区域绿豆慢生根瘤菌的遗传多样性和系统发育研究

利用16SrRNAPCR-RFLP、16SrRNA序列分析以及16S-23SrRNAIGS(IntergeneticSpacer)PCR-RFLP技术对分离自中国主要生态区域的44株慢生型绿豆根瘤菌和5株参比菌株进行了遗传多样性和系统发育研究。16SrRNAPCR-RFLP分析表明:在76%的相似水平上,所有供试菌株可分为三大类群:群I由LYG1等13株慢生根瘤菌组成,该群在系统发育上与B.japonicum和B.liaoningense的参比菌株存在一定的差异;群Ⅱ由XJ1等21株供试菌株、B.japonicum和B.liaoningense的代表菌株组成;群Ⅲ由10株来自广东和广西的菌株和B.elkanii的代表菌株组成。16S-23SrRNAIGSPCR-RFLP分析将供试菌株分为A、B两大群。群A由34株供试菌株、B.japonicum和B.liaoningense的代表菌株组成。在85%的相似性水平上,可再分为AⅠ、AⅡ和AⅢ3个亚群。群B由10株分离自广西和广东的菌株和B.elkanii的代表菌株组成。在85%的相似性水平上,可再分为BI和BⅡ两亚群,表现出一定的多样性。与16SrRNAPCR-RFLP相比,16S-23SrRNAIGSPCR-RFLP具有更高的解析度,供试菌株表现出更加丰富的遗传多样性。分离自中国新疆、广东和广西等地的菌株在分群上具有较为明显的地域特征。     

固氮酶结构基因在快生型大豆根瘤菌中的定位

分离纯化了一批我国快生型大豆根癌蘸。测定了它们的固氮酶稀性和寄主专一性,发现相同菌株在不同大豆豆种植株上的结瘤和固氮活性差异甚大。蓑国USDA 191和193似寄主专一性较高,在我们所使用的豆种上结瘤能力很低,固氮活性也不高。对根瘤菌中巨型质粒的数量分布进行了分离分析,表明所有快生型大豆根瘤菌都包含1—3个巨型质粒(分子量范围;30-25Md>。用含有固氮酶结构基因的质粒pSA30作为探针对巨型质粒进行杂交,结果表明即使是快生型大豆根瘤菌,固氮酶结构基因也并不一定定位于巨型质粒上。另外,在若干菌株中发现psA30与二个巨型质粒同时杂交,表明有可能nif HDK或其部分基因的拷贝是分散的。     

用AFLP技术检测慢生型花生根瘤菌竞争结瘤的研究

以 5株慢生型花生根瘤菌和天府 3号花生为材料 ,用 AFLP技术研究了慢生型花生根瘤菌 Spr2 - 9、Spr3- 3、Spr3- 5、Spr4- 5和 Spr7- 1的遗传特性和竞争结瘤能力。结果显示 ,供试条件下 ,传代次数对菌株的遗传性状无明显影响 ,2 8℃培养条件下 ,花生根瘤菌连续传 96代 ,其 AFLP指纹未发生明显变化 ;37℃培养 ,仅 Spr3- 3和 Spr3- 5能够存活并正常生长 ,其 AFLP指纹也未发生明显改变 ,然而其它菌株不能生长。将供试慢生型花生根瘤菌分别接种天府 3号花生 ,光照培养 30 d后 ,随机各取 4个根瘤 ,从根瘤中提取类菌体 DNA进行 AFLP分析 ,各根瘤类菌体 DNA的 AFLP指纹图谱与该菌株纯培养物 AFLP指纹相同。将 5个菌株混合接种天府 3号花生 ,不同菌株的占瘤率存在差异 ,Spr3- 3和 Spr3- 5的竞争结瘤能力最强 ,两菌株的占瘤率之和为 85.4% ;Spr4- 5的占瘤率为 1 2 .2 % ;Spr7- 1为 2 .4% ;而 Spr2 - 9的竞争结瘤能力最差。本试验结果说明 ,AFLP技术用于根瘤菌生态和竞争结瘤能力研究 ,具有下列优点 :简易、快速、准确 ;直接取豆科植物的根瘤提取 DNA,进行原位研究 ;在不改变菌株遗传特性 ,即不使用突变株的前提下 ,可以直接测定已知菌株的竞争结瘤能力     

湖北地区快生型大豆根瘤菌的质粒及结瘤基因的初步定位

从湖北省潜江县和监利县的4个采集点分离纯化了26株快生型大豆根瘤菌。质粒分离分析结果表明:所测快生型大豆根瘤菌中均有1—3条质粒带,分子量范围在50—300 Md之间。从26株快生型大豆根瘤菌中,选出分属两个血清型的5个菌株,依据根瘤菌nodABC基因在所有根瘤菌种中的结构同源性,对快生型大豆根瘤菌的结瘤基因(nod)进行了初步定位,其结果表明:R173、X143、B21、B2,D13菌株的质粒DNA中没有与nod ABC基因同源的片段存在,而R173、X143、B21、D13菌株的总DNA中含有部分no