猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达

以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDVVP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%。Westernblotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础。     

猪水泡病病毒VP1基因抗原区的原核表达

利用RTPCR和nested PCR(nPCR)技术扩增出猪水泡病病毒VP1基因的抗原区，将其克隆到表达载体pProEXHTb中，获得重组质粒，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，目的基因插入的位置、大小和读码框均正确。将重组质粒导入BL21（DE3），经IPTG诱导表达后SDSPAGE检测表明，重组菌能表达猪水泡病病毒VP1抗原区蛋白；Western blot检测表明，诱导表达的抗原区蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。     

猪水泡病病毒VPl基因抗原区的原核表达

利用RT-PCR和nested PCR(nPCR)技术扩增出猪水泡病病毒VPl基因的抗原区,将其克隆到表达载体pProEX-HTb中,获得重组质粒,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确。将重组质粒导入BL21(DE3),经IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测表明,重组菌能表达猪水泡病病毒VPl抗原区蛋白;Western blot检测表明,诱导表达的抗原区蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。     

非洲猪瘟病毒VP73基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达

参照Genebank中非洲猪瘟VP73基因序列,人工合成的VP73全基因克隆至pMD 18-T克隆载体质粒中,采用PCR扩增得到1188 bp的VP73基因;将VP73基因片段亚克隆插入pBAD/Thio表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP73基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了非洲猪瘟病毒VP73基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP73蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002 %的L-Arabinose进行诱导,4 h后表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子量约60 kDa,表达产量约占菌体总蛋白的30％。Western blotting和ELISA检测表明,表达的融合蛋白能与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应,说明表达获得的产物为非洲猪瘟病毒VP73融合蛋白,且具有良好的反应原性,这为应用该表达蛋白抗原制备ASFV免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。     

蓝舌病病毒vp7基因的表达及其产物在c-ELISA中的应用

获得稳定、高效的具有良好抗原性的蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)vp7基因重组抗原.将BTV编码群特异性抗原VP7的S7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中,构建S7克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析.与已报道的多株BTV编码VP7的基因比较后发现,所测定毒株的核苷酸序列与BTV10型的S7基因同源性高达98.7%,推测的氨基酸同源性为99.3%,证实为BTV的S7基因.然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,转化LGM194细胞,经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得BTV S7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体.经L-araboinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP7蛋白抗原.SDS-PAGE、ELISA试验表明,表达蛋白为融合蛋白,具有反应原性,分子量约54.5kD,重组蛋白的获得率为1.52mg/g湿菌,其表达产量约占菌体总蛋白的12%左右,相当于93.5mg/L菌液.融合蛋白中含有BTV VP7特异性蛋白抗原,可作为c-ELISA包被抗原,为蓝舌病的免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.     

水泡性口炎病毒核蛋白基因的表达及初步应用

将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建N基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,经PCR限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得N基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了水泡性口炎病毒N基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达N蛋白抗原。SDS-PAGE、Western blotting及间接ELISA试验结果表明,表达蛋白为融合蛋白,质量约63.5 kD,其表达产量约占菌体总蛋白的16％,相当于92mg/L。融合蛋白中含有水泡性口炎病毒群特异性的核蛋白抗原,应用表达的VSV核蛋白抗原建立了酶联免疫吸附试验,通过对186份山羊、豚鼠实验动物人工感染VSV的血清样品和参考血清样品的检测,并与微量血清中和试验进行了比较,结果表明：以表达的VSV核蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验是一种特异性强、敏感性高、快速、简单、安全的检测方法,抗原制备成本低。     

蓝舌病病毒vp7基因的表达及其产物在c—ELISA中的应用

获得稳定、高效的具有良好抗原性的蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)vp7基因重组抗原。将BTV编码群特异性抗原VP7的S7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中,构建S7克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。与已报道的多株BTV编码VP7的基因比较后发现,所测定毒株的核苷酸序列与BTV10型的S7基因同源性高达98．7％,推测的氨基酸同源性为99．3％,证实为BTV的S7基因。然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,转化LGM194细胞,经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得BTV S7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体。经L-araboinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP7蛋白抗原。SDS-PAGE、ELISA试验表明,表达蛋白为融合蛋白,具有反应原性,分子量约54．5kD,重组蛋白的获得率为1．52mg／g湿菌,其表达产量约占菌体总蛋白的12％左右,相当于93．5mg／L菌液。融合蛋白中含有BTV VP7特异性蛋白抗原,可作为c-ELISA包被抗原,为蓝舌病的免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础。     

猪细小病毒VP2与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌表面共表达

将分别编码猪细小病毒(PPV)主要免疫保护性抗原VP2蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因插入乳酸杆菌细胞表面表达载体pPG中, 成功构建了重组表达载体pPG-VP2-LTB, 将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393, 获得了表达猪细小病毒VP2-LTB融合蛋白的重组乳酸菌表达系统, 经2%乳糖诱导, SDS-PAGE和Western-blot检测表明, 有大小约78 kD的蛋白得到了表达, 具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性, 全细胞ELISA结果表明, LTB同     

轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白同一位点表达比较研究

目的:评价轮状病毒(RV)VP4两个抗原表位插入VP6载体蛋白同一位点所表达的重组嵌合蛋白免疫学性质及在研制嵌合蛋白疫苗中的意义。方法:采用分子克隆和基因重组技术将RV VP4的两个抗原表位插入到VP6载体蛋白同一位点上,构建重组抗原表达质粒,表达携带不同抗原表位的重组嵌合蛋白,用Western blot和中和试验分析重组嵌合蛋白的抗原反应性和免疫原性。结果:成功构建了两个嵌合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达;表达的嵌合蛋白可与相应抗体特异性反应;可诱导豚鼠产生特异性血清抗体;抗嵌合蛋白血清抗体可特异性识别载体蛋白VP6F,Wa株病毒的VP6和VP4蛋白,可中和Wa株病毒在MA104细胞上的感染性;结果表明,所构建和表达的两个以VP6为载体的VP4抗原表位嵌合蛋白具有较高抗原反应性和免疫原性;嵌合蛋白携带的VP4抗原表位具有增强载体蛋白免疫原性作用;为研制新型RV重组蛋白疫苗的奠定了较好的基础。     

非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段（vp73l）。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21（DE3）,经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在E.coli BL2（DE3）高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism