黄曲酰化酶拆分酰化-DL-氨基酸及D型氨基酸的制备

<正> 酶是生物细胞合成的具有高效专一催化活力的一类特殊蛋白质。利用酶族中酰化酶拆分化学法合成或消旋的D L-氨基酸。可以得到纯的L型和D型的氨基酸。通常用于工业生产的酰化酶有猪肾酰化酶。淀粉酰化酶、黄曲酰化酶等。在拆分D L型甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、色氨酸、苄基丝氨酸等几十种氨基酸中,L型氨基酸产率为50～     

D-氨基酰化酶拆分D,L-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸

进行了以D,L-苯丙氨酸为原料经D-氨基酰化酶制备D-苯丙氨酸的研究。乙酰-D,L-苯丙氨酸浓度为0.5mol.L-1,给酶量为3×104U.L-1时,24 h拆分率可达到97%。采用阳离子交换树脂进行了拆分液中的D-苯丙氨酸的分离,D-苯丙氨酸的收率为95.4%。采用醋酸酐作为催化剂,在145℃的条件下,乙酰-L-苯丙氨酸可以消旋成乙酰-D,L-苯丙氨酸继续拆分。     

固定化N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶拆分消旋蛋氨酸

基因工程菌BL21/pET22b-argE可高效表达N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶。将含酶细胞包埋于海藻酸钙凝胶中制成固定化细胞酶,用于消旋蛋氨酸的拆分,并将其拆分能力、拆分速度及操作稳定性与游离细胞酶相比较。结果表明:单批次转化固定化细胞酶的拆分能力和游离细胞酶相近,拆分速度较慢;但多批次转化的操作稳定性显著高于游离细胞酶。重复利用8次后的固定化细胞酶仍保有95%以上的酶活力,重复利用5次后的游离细胞酶活已降至20%左右。每克湿菌泥在游离和固定化条件下重复拆分产L-蛋氨酸的量分别为74.16mmol和241.93mmol。酶拆分液中的L-蛋氨酸经重结晶后光学纯度为98.3%。固定化细胞酶比游离细胞酶更具有工业化应用的潜质。     

重组菌BL21/pET22b-argE固定化条件研究

研究了基因工程菌BL21/pET22b-argE固定化条件。最适包埋材料为海藻酸钙,优化后的包埋条件为海藻酸钠20g.L-1(含有12 g.L-1菌液)滴至2%CaCl2溶液中,固定化16 h。固定化细胞酶拆分蛋氨酸的速率比游离细胞酶慢,但其终极拆分能力与游离细胞酶相当。固定化细胞酶反复利用8批时酶活仍保持在95%以上,具有很好的工业应用优势。     

用生物反应器生产L-氨基酸

现已有几种L-氨基酸是用生物反应器中的酶或全细胞生产的。最早采用这种技术的例子之一是日本L-天冬氨酸的生产。最近放大了由肉桂酸和氨生产L-苯丙氨酸的生物反应器法,产物效价达60克/升以上,原料转化率约为90％。     

用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶拆分DL-苯丙氨酸

为了将手性化合物D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸进行分离,利用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶催化的方法对其拆分．试验结果表明,用DL-苯丙氨酸合成N-乙酰-DL-苯丙氨酸,得率为88.7％．木瓜蛋白酶、海藻酸钠 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶(IPSAC)、尼龙布固定化木瓜蛋白酶(IPN)催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺时,对催化合成过程影响最大的因素分别是溶液中的离子强度、溶液中的离子强度、反应温度;溶液中的离子强度与pH对合成的影响较大．本试验得出分别用木瓜蛋白酶、IPSAC、IPN催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺的3个最佳方案;用此3个方案合成时,产率分别为61.2%、54.7%、36.3%．N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺水解生成L-苯丙氨酸,产率59.2%,光学纯度为96.6％．N-乙酰-D-苯丙氨酸水解生成D-苯丙氨酸,产率61.7%,光学纯度为95.7％．     

Eupergit C250L固定化D-海因酶及其催化性质

D-海因酶是海因酶法制备D-氨基酸的关键酶。利用Burkholderic cepecia1003菌发酵产酶,所得海因酶纯化后,以Eupergit C250L为载体进行共价固定化。分别考察了酶液蛋白浓度、固定化时间对蛋白固定量和酶活回收率的影响以及固定化前后海因酶催化性质的变化。结果表明:较高的酶液蛋白浓度和较长的固定化时间均有助于改善海因酶的固定化效果;固定化可显著提高海因酶的最适作用温度,但对其最适作用pH影响不大;固定化后海因酶对D,L-BH和MH的米氏常数均有较大幅度的降低。固定化酶反应器的实验表明:40℃下,底物(D,L-BH)1.0 g.L-1,体积流速1.0 mL.min-1,经21 h转化,产物N-Phe质量浓度可达0.47 g.L-1,转化率达43.21%。     

反应条件下苯丙氨酸解氨酶的活力稳定性

在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的作用下由肉桂酸和氨合成L-苯丙氨酸(L-Phe)是酶法合成该氨基酸的重要途径,国外已利用该途径进行L-苯丙氨酸的工业生产,但是该过程仍存在着转化率低和酶活力稳定性差的问题。为解决这些问题,有必要在现有基础上开展提高酶活力稳定性的研究。     

功能基化聚丙烯酸甲脂固定化氨基酰化酶的研究

以功能基化聚丙烯酸甲酯为载体制备固定化氨基酰化酶时,载体制备时的交联度,致孔剂用量和混合致孔剂比例均会影峋酶的固定化效率。结果表明25％交联度和loo％致孔剂用量制备的载体最佳。用此载体固定化氨基酰化酶可提高酶对高底物浓度、离子强度、温度、pH、有机溶剂和蛋白质变性剂的耐受能力。用固定化酶柱式反应器连续拆分N－乙酰基－DL－苯丙氨酸,使用一个月仍可保留90％的酶活力。     

L-苯丙氨酸生产的代谢工程研究

L-苯丙氨酸是一种重要的食品和医药中间体。工业上一般采用酶法和发酵法来生产L-苯丙氨酸。代谢工程的兴起,使得更加理性的改造菌株成为可能,这更加促进了发酵法的广泛应用。主要介绍了代谢工程在L-苯丙氨酸生产菌的改造中的应用情况,其中涉及苯丙氨酸生物合成途径中相关基因及其酶的调控、中央代谢途径的改造和芳香族氨基酸生物合成支路的修饰。并探讨了将来的发展前景。     

固定化脂肪酶催化制备L-薄荷醇

用大孔树脂NKA固定高选择性的脂肪酶,催化有机相中转酯化反应,从而拆分八异构体消旋薄荷醇来制备L-薄荷醇。研究pH、载体与酶比例对固定化酶制备的影响及固定化酶的反应稳定性;考察温度、转酯化过程醇酯比例、及底物醇异构组成变化对拆分效果的影响。结果表明:固定化酶的最适pH为8,载体与酶的比例为5∶1时,所得固定化酶的反应稳定性比游离酶的反应稳定性提高了约50%;转酯化反应的最优温度为40℃,醇酯比例为1.5∶1时最佳,改进八异构体消旋薄荷醇组分比例后,非对映体选择率dep达到了95.1%。     

氨基磁性微球固定化木瓜蛋白酶及其应用

目的:采用实验室自制氨基磁性微球固定化木瓜蛋白酶,并将其应用于啤酒中蛋白质的水解.方法:考察不同给酶量、戊二醛浓度、固定时间等因素对固定化木瓜蛋白酶的影响.将固定化酶用于啤酒的处理,测定其游离氨基酸变化.结果:实验表明给酶量1.2mg/ml,戊二醛浓度5%,固定化时间4h为固定化最佳条件.酶活力测定表明,在最优化条件下制备的固定化酶较溶液酶具有更低的Km值(0.489%:3.412%),更好的酸碱(6.8:7.2)和温度耐受性(77℃:67℃),操作和储藏稳定性也得到了很大提高.固定化酶水解啤酒中蛋白质后,啤酒混浊度降低了0.013个单位,酪氰酸和苯丙氨酸等游离氨基酸有不同程度的增加,啤酒色泽和口味得到了改善.结论:磁性固定化木瓜蛋白酶较溶液酶有更佳的稳定性和更好的可操作性,具有广泛的应用前景.     

红花石蒜苯丙氨酸解氨酶催化合成N-甲基-L-苯丙氨酸（英文）

【背景】N-甲基-L-苯丙氨酸是一种N-烷基化芳香氨基酸,是重要的手性合成单元/中间体/组成成分,在医药、农业、食品等领域有重要应用价值的代谢产物中广泛存在。N-烷基化芳香氨基酸的合成与制备仍具有巨大的挑战。【目的】在研究加兰他敏的生物合成过程中,我们从产加兰他敏的红花石蒜中克隆并表征苯丙氨酸解氨酶LrPAL3。LrPAL3催化区域及对映选择性的氢胺化反应得到L-苯丙氨酸。通过生物信息学分析,推测LrPAL3可能催化反式-肉桂酸的一步N-甲基胺化反应得到N-甲基-L-苯丙氨酸。【方法】将反式-肉桂酸与甲胺,以及表达LrPAL3的大肠杆菌全细胞一起孵育。HPLC-DAD及HRESIMS分析表明,上述反应产物为N-甲基-苯丙氨酸。为确定该产物的立体构型,将上述催化反应放大,通过分离纯化得到该酶催化反应产物。【结果】该化合物的氢谱数据及比旋光数据与N-甲基-L-苯丙氨酸标准品的数据一致。由此说明,LrPAL3能够催化反式-肉桂酸和甲胺发生N-烷基胺化反应,区域和立体专一性地生成N-甲基-L-苯丙氨酸。【结论】本研究为手性N-烷基氨基酸的不对称合成提供了一种全新的绿色、高效生物催化剂。通过对LrPAL3的蛋白质定向进化及代谢工程,将会进一步扩展LrPAL3的催化反应范围,以多种N-烷基胺类及取代的苯基丙烯酸为底物,实现手性N-烷基-芳基氨基酸的高效区域及立体选择性生物合成。     

L-苯丙氨酸产生菌的选育

本文报导了不产酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)经亚硝基胍处理,在一定浓度的L-苯丙氨酸结构类似物——对氟苯丙氨酸(DLP-Fluorophenylalalline,PFP)存在下,筛选获得了一批能产生与积累L-苯丙氨酸的抗代谢突变菌株,其中PFP-17突变菌株的产物在纸层析谱上L-苯丙氨酸的显色点较深,定量测定产酸为1.5mg/ml经两次自然分离获得的17-3-4菌株产酸特性稳定,在以葡萄糖为主要碳源,初糖为4.5%的摇瓶发酵中。产酸可达5.5mg/ml,产物经氨基酸自动分析代鉴测确证其主要产物是L-苯丙氨酸,此突变菌株经进一步选育所得的突变菌株3-PAP-42在提高初糖为6%时,发酵产酸可达8.28mg/ml。     

环氧树脂固定化L-谷氨酸氧化酶

通过环氧树脂作为载体对经(NH4)2SO4盐析处理后的L-谷氨酸氧化酶(LGOX)进行固定化,优化固定化工艺条件,并利用固定化LGOX转化产α-酮戊二酸(α-KG)。结果表明:饱和度45%的(NH4)2SO4为最佳盐析浓度;当选用环氧树脂ES-105作为固定化载体、树脂加量为20 m L酶液(14 U/m L)加入3.5 g载体、固定化K3PO4缓冲液浓度为0.2 mol/L(p H 7.0)、固定化温度25℃、固定化时间24 h时,固定化LGOX酶活力最高,其酶活回收率为85.9%,比酶活55.7 U/g。利用该固定化酶转化L-谷氨酸产α-KG,当谷氨酸钠质量浓度为100 g/L,反应20 h,产物收率达98.2%。固定化酶重复使用14批次后,产物收率仍有90%以上;重复使用20批,收率有83.2%。因此,该固定化酶具有具良好的操作稳定性。     

酶法生产L-高苯丙氨酸的研究进展

L-高苯丙氨酸(L-homophenylalanine,L-HPA)作为一种重要的非天然氨基酸,是合成治疗高血压的普利类药物等的关键中间体,具有广阔的市场前景。目前L-高苯丙氨酸的合成主要依赖于化学法,但化学合成L-高苯丙氨酸具有原料昂贵、步骤繁琐和污染严重等缺点,限制了广泛应用。因此,国内外研究者对L-高苯丙氨酸的酶法生产进行了深入的研究。本文就目前酶法合成L-高苯丙氨酸的工艺,包括脱氢酶法、转氨酶法、海因酶法和脱羧酶法的研究进展进行了综述,为酶法合成L-高苯丙氨酸提供一定的借鉴,为最终实现L-高苯丙氨酸的酶法工业化生产奠定基础。     

氨基树脂固定化L-苏氨酸醛缩酶及其应用*

L-苏氨酸醛缩酶(L-Threonine aldolase,L-TA)可以催化甘氨酸和醛合成β-羟基-α-氨基酸。β-羟基-α-氨基酸具有两个手性中心,是多种手性药物的中间体。但是,游离的L-TA难以重复利用,分离纯化困难,严重阻碍了工业化应用。固定化技术可以有效解决这些问题。利用氨基树脂NAA固定化来源于Bacillus nealsonii的L-苏氨酸醛缩酶,采用戊二醛作为交联剂,经过条件优化确定最佳固定化条件为:加酶量13 U、载体量0.6 g、0.4%(V/V)戊二醛、活化时间2 h、pH 8.5、35℃、固定化5 h。在此条件下,固定化酶酶活回收率为85.7%。在30℃下半衰期可达59天,为游离酶的6.5倍。将其应用于合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸,使用460 h后,残余酶活为79.4%。进一步开发了载体再利用策略,将失活固定化酶表面的氨基用戊二醛活化后,再与新的游离酶进行固定化,实现载体的再利用。利用该方法载体可重复利用两次,制备的固定化酶仍能使用460 h。该方法大大降低了固定化成本,为固定化L-TA的工业化应用打下坚实的基础。     

Arthrobacter K1108乙内酰脲酶转化产物的鉴定

用 Arthrobacter sp.K1 1 0 8的完整细胞为酶源 ,对 DL- 5 -苄基乙内酰脲进行了酶法转化 ,对转化产物进行了提取和精制 ,并通过理化分析和光谱分析进行了鉴定 ,证实所得产物确实为 L-苯丙氨酸 ,同时证实 K1 1 0 8的乙内酰脲酶是 L-选择性的     

微生物活细胞的固定化

随着固定化酶和固定化细胞技术的发展,近年来人们十分注意活细胞的固定化。众所周知,以往利用固定化细胞生产L-天门冬氨酸和L-苹果酸的酶反应都是单一酶催化的,这种细胞是死的,而仅仅细胞内的酶有活性。可     

氨基酸制造工业中的生物催化反应器(续)

<正> 生物催化反应器的应用例虽然很多,但实际应用于工业生产者不到10例,如表3,其中用于氨基酸制造工业的有二、三例,如固定化氨基酰化酶连续拆分DL—氮基酸,固定