鼠单克隆抗-HBs的单克隆抗独特型抗体的制备及其免疫原性的研究 Ⅱ.Ab_2—1的免疫原性研究

用一株单克隆抗独特型抗体细胞株,Ab_2-1免疫4只BALB/c小鼠和2只家兔。每只小鼠每次经腹腔接种100#gAb_2-1,共接种4次;每只家兔每次经皮下注射1mgAb_2-1,共注射4次。经免疫的小鼠和家兔都产生了抗-HBs,经两种竞争性抑制试验证实,这些抗-HBs是特异性的。小鼠抗-HBs滴度为2~(-6)至2~(-9);家兔抗-HBs滴度从2~(-10)至2~(-12)。这些资料提示:单克隆抗独特型抗体能模拟HBsAg,具有类似HBsAg的免疫原性。     

抗独特型抗体与T细胞记忆的关系

记忆T细胞作为人体免疫系统中的一个组成部分,在免疫应答中发挥着至关重要的作用,因此利用抗独特型抗体制备诱导产生记忆T细胞的疫苗是免疫学领域的一个重要方向。抗独特型抗体Fab段具有与特异性抗原相似的抗原决定簇的结构,其作为抗原替代物制备的疫苗所激发机体产生的记忆T细胞具有特异性强和安全性高的特点,成为一种比较理想的疫苗.就抗独特型抗体与T细胞记忆之间的联系及其应用效果作一简要综述。     

自身抗独特型抗体的产生及其在免疫应答调节中的作用

自身抗独特型抗体(auto—ald)广泛存在于机体对多种抗原的免疫应答过程中,并通过与独特型(Id)相互作用,参与体液和/或细胞免疫应答的调节。auto-aId的调节作用包括:(1)通过抑制B细胞合成相应的Id抗体或激活Id特异性T细胞,后者作用于效应细胞,而反馈性抑制机体对起始抗原的免疫应答(向下调节);(2)内影像auto-aId模拟抗原,促进相应Id的表达(向上调节)。其调节作用在多数情况下对机体有利,如维持体内Id—抗—Id网络的稳定性,促进某些自身免疫病的恢复等。但在某些情况下则对机体有害,甚至导致某些受体自身免疫病的发生。     

肺炎支原体抗独特型卵黄抗体的制备与鉴定

目的制备肺炎支原体(M.pneumonia)抗独特型卵黄抗体(vitelline Ab2),鉴定其生物学特性,探讨其作为动物疫苗的潜在应用价值。方法首先制备兔、小鼠抗肺炎支原体抗体(Ab1),筛选出对肺炎支原体有免疫中和性的兔抗体和小鼠抗体,再用兔抗体免疫产蛋鸡,筛选并收集有高效价抗独特型卵黄抗体的鸡蛋,分离蛋黄,破碎蛋黄组织,用蒸馏水稀释和酸化提取抗独特型卵黄抗体。用冷酒精沉淀法纯化抗独特型卵黄抗体。用ELISA检测肺炎支原体抗独特型卵黄抗体(Ab2)的效价、质量浓度和特异性。用竞争抑制试验和动物免疫检测卵黄Ab2β。结果兔抗肺炎支原体抗体的效价为1×10~(-6),Ab1的效价为1×10~(-4)～1×10~(-5);以上抗体均只和肺炎支原体发生免疫反应,不和解脲支原体发生免疫反应;它们和肺炎支原体混合后能中和肺炎支原体的活性,使其不能在条件培养基生长。Ab2效价为1×10~(-5),质量浓度为8 mg/mL。该抗独特型卵黄抗体只和Ab1发生免疫反应,不和小鼠抗解脲支原体抗体发生免疫反应。该Ab2和Ab1结合能被肺炎支原体竞争抑制,且Ab2能诱导小鼠产生肺炎支原体抗体(Ab3),该Ab3能和肺炎支原体发生免疫反应。结论成功制备了特异性强、效价高的β型Ab2,具有作为动物肺炎支原体疫苗的潜在应用价值。     

抗EHFV的独特型抗体在小鼠体内诱导免疫应答的研究

本文介绍用流行性出血热（EHF）病毒J10株制备单克隆抗体（McAb）,以及用7个McAb免疫家兔,使其产生抗EHF病毒McAb的抗体即抗独特型 抗体（Ab2).Ab2能在体外同出血热病人恢复期血清和EHF病毒免疫的兔血清发生特异性结合。再经EHF－McAb亲和层析法分离提纯Ab2,免疫BALb/c小鼠,将所获得的免疫血清（Ab3）用荧光和ELISA分别加以测定。结果表明,抗－抗独特型抗体可在体外识别EHF病毒,而不能同病病人恢复期血清发生结合,从而支持免疫网络学说,可能为我们提供一种新型的抗原来源途径。     

抗EHFV的独特型抗体在大鼠体内诱导免疫应答的研究

本文介绍用流行性出血热（EHF）病毒J10株制备单克隆抗体（McAb),以及用7个McAb免疫家兔,使其产生抗EHF病毒McAb的抗体即独特型抗体（Ab2）。Ab2能在体外同出血热病人恢复期血清和EHF病毒免疫的兔血清发生特异性结合。再经EHF－McAb亲和层析法分离提纯Ab2,免疫BALb/c小鼠,将所获得的免疫血清（Ab3）用荧光和ELISA分别加以测定,结果表明,抗－抗独特型抗体可在体外识别EHF病毒,而不能同病病人恢复期血清发生结合,从而支持免疫网络学说,可能为我们提供一种新型的抗原来源途径。     

人绒毛膜促性腺激素抗独特型抗体在小鼠中的免疫反应

我室制备了人绒毛膜促性腺激素(hCG)的抗独特型抗体,它们与hCG有相似的抗体和受体结合位点,因而认为它们可能具有hCG内镜像结构。如果这些抗独特型抗体也具有与hCG类似的免疫原性,可望利用它们来配合或代替hCG制备更好的免疫避孕疫苗。我们用一种hCG抗独特型抗体(Anti-BAH_1)免疫小鼠可得到抗hCG抗体,这些抗体占所产生的Anti-Anti-BAH_1抗体的1—2％,最高滴度可达1:2万左右。这个滴度可保持2个月左右,以后逐步下降,在停止免疫半年后抗体滴度降到最高滴度的15.6％。用Anti-BAH_1与hCG同时免疫,对hCG的免疫反应有一定抑制作用,但先用Anti-BAH_1免疫对随后的hCG免疫反应有一定增强作用。表明利用抗独特型抗体可能调控对hCG的免疫反应。这种调控作用与所采用的免疫方式及抗原剂量有关。     

脱落酸人工抗原合成及多克隆抗体制备

目的:为了对植物细胞中的脱落酸(ABA)进行定量和定位分析,研究了脱落酸人工抗原的合成以及多克隆抗体的制备。方法:用重氮化法将ABA分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)联结,得到ABA的免疫抗原和包被抗原,并采用紫外全波长扫描和SDS-PAGE对合成的抗原进行了鉴定。以经过鉴定的抗原免疫白兔,制备出ABA的多克隆抗体;采用间接酶联免疫法(ELISA)对抗血清进行效价检测,通过离子交换层析法获得纯化的抗体。结果:ABA与BSA的平均偶联比为5.3∶1,抗血清效价为1∶16000。结论:人工抗原和多克隆抗体制备成功,为采用ELISA和免疫胶体金技术(ICG)检测ABA提供了有效工具。     

卵巢癌抗独特型单链抗体的人源化——抗独特型微抗体的构建与表达

为了降低人抗鼠抗体反应 ,获得满意的免疫原性 ,将模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体人源化 .采用重叠PCR和基因工程的技术 ,将 6B11ScFv基因的轻链和重链颠倒 ,成为 6B11VL VH.再与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合 (VL VH CH3) ,构建抗独特型微抗体的原核表达载体 .转化E .coliBL2 1(DE3)后用IPTG诱导表达 .经SDS PAGE分离显示 ,在 5 0kD左右处有一诱导蛋白带 .不连续非变性凝胶电泳显示 ,表达产物分子量为 10 0kD左右 .采用ELISA、竞争抑制实验、West ern印迹对其进行活性测定 .结果表明 ,人源化的抗独特型微抗体具有特异性双价结合卵巢癌单克隆抗体COC16 6 9和识别人免疫球蛋白IgG1的活性 ,成功地将鼠源的scFv的人源化     

卵巢癌抗独特型单链抗体3D_5ScFv的高效表达

对 3D5卵巢癌抗独特型单链抗体进行原核系统的高效表达 .采用DNA重组技术 ,将 3D5ScFv克隆到原核表达载体pTMF中 ,重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;IPTG诱导表达 ,SDS PAGE鉴定蛋白质的分子量约为 2 8kD ;通过直接ELISA、竞争抑制实验和Western印迹分别检测其活性 .3D5ScFv以包涵体的形式获得高效表达 ,占菌体总蛋白 36 % ,变性复性后蛋白的纯度大于 90 % ,表达蛋白能与卵巢癌抗体OC12 5特异性结合 ,并能有效抑制卵巢癌抗原CA 12 5与卵巢癌抗体OC 12 5的特异性的结合 .3D5ScFv在原核系统中获得了高效表达 ,并具有较好的活性 ,为抗独特型抗体的人源化改造提供必要的元件     

黄曲霉毒素B1抗独特型抗体的制备和应用研究I抗独特型抗体的制备和性质研究

以黄曲霉毒素B1(AFB1)与牛血清蛋白（BSA)的连接物AFB1-BSA注射免疫兔子获得抗AFB1抗血清,经(NH4)2SO4沉淀、酶切处理与亲和层析分离纯化后,得到抗AFB1独特型抗体Ab1及其酶切片段Fab1,然后再将Fab1注射免疫BALB／c小鼠,得到抗(抗AFB1)独特型抗体Ab2及其酶切Fab2。研究了Ab2和Fab2的性质,结果表明,Ab2和其Fab2部仅与Ab1及其Fab1反应,而不和抗桔霉素等其他抗体反应,有较好的特异性。以AFB1与卵清蛋白(OV)的连接物AFB1-OV为包被抗原,Fab1为反应抗体,Ab2和Fab2为竞争抗原,达到50％的竞争抑制率时,Ab2和Fab2的浓度分别为3．98ug／ml和1．12ug／ml;而以Ab2和Fab2为包被抗原,Fab1为反应抗体,AFB1为竞争抗原,达到50％的竞争抑制率时,AFB1的浓度分别为44．67ug/L和6.31ug／L,这表明无论是Ab2还是Fab2都和AFB1有很好的内影像关系,可以作为AFB1的替代品用于AFB1的免疫学检测。但是相对而言,由于Fab2的分子量小,反应时的空间位阻小,所以Fab2更适合于用作AFB1的替代品。     

布鲁氏菌抗独特型抗体的研究

在建立布鲁氏菌单克隆抗体细胞株的基础上,筛选具有保护作用的单抗A7免疫家免制备抗独特型抗体(简称二抗)。经阻断试验和竞争抑制试验证实,该二抗具有抗原“内影象”。将其提纯后配制成甘油佐剂苗免疫豚鼠和小白鼠．检测结果表明：免疫豚鼠和小白鼠产生了布鲁氏菌凝集抗体;免疫小鼠的循环T ANAE-细胞百分数明显高于对照组;免疫豚鼠在免疫后4个月时强毒菌株攻击有79．2％获得保护。因此认为,该二抗不仅具有抗原的。内影象”结构,而且具有良好的免疫原性,可供作疫苗用。     

抗独特型抗体研究的新进展

独特型是存在于抗体分子某些部位上的一种特殊基因。该基因具有抗原性,能在自体或异体内诱导出针对该基因的特异性抗体——抗独特型抗体。近年大量的动物实验证明,抗独特型抗体可以作为新一代免疫制剂,用以弥补现有疫苗的不足。同时,它还可用于癌症和自身免疫性疾病的治疗。     

糖类抗原的抗独特型抗体疫苗

糖类抗原以其免疫性较弱,常规疫苗的免疫效果一般欠佳,特别是对新生儿的免疫更是如此。糖类抗原又以其本身结构上的复杂人工合成较为困难,也不能通过重组DNA技术由基因工程直接制得。为此,不少免疫学家都在探寻有效的抗糖疫苗。本文作者长期从事糖类抗原的抗位特型抗体研究,认为目前的研究为寻求一条糖类抗原的抗独特型抗体疫苗奠定了基础;列举了细菌的果聚糖,大肠杆菌K13多糖,克氏锥虫的表面糖蛋白, A组链球菌糖,脑膜炎奈瑟氏菌C组多糖,以及肿瘤相关抗原上的糖表位等的研究材料。本文为1991年出版的抗独特型抗体疫苗一书中的一章。     

抗独特型抗体Ab2β的制备及其应用

抗独特型抗体Ab2β由于含有抗原内影像结构而表现出抗原的部分生物活性。由于Ab2β具有模拟抗原的功能,使其在蛋白质、受体及疫苗等研究领域中的应用越来越广泛。文中简述了抗独特型抗体Ab2β的制备和应用及其应用所存在的问题,并讨论了Ab2β抗原内影像功能的结构基础,旨在展望其应用前景。     

鼻咽癌患者血清中Epstein-Barr病毒早期抗原特异性抗体的IgA类抗独特型抗体的检测

用3.5％PEG(MW6000)预先处理被检血清以除掉免疫复合物及干扰抗原之后,用新建立的ELISA方法测定血清中Epstein-Barr病毒早期抗原特异性抗体的抗独特型(Anti-Id)抗体。67例鼻咽癌患者中,80％IgA类的Anti-Id抗体阳性(P/N值≥2.1),而56例正常人群除1例阳性外,其余均阴性。测定46例鼻咽癌患者血清EA/IgA滴度与Anti-Id的关系表明,Anti-Id抗体P/N值与IgA/EA滴度呈负相关(r=-0.6,P<0.001)。12例鼻咽癌病人血清中EA抗体的IgG类Anti-Id抗体则与正常人无显著差别。     

基于纳米抗体CDR3区抗原表位展示制备生存素抗体及其鉴定

目的:通过纳米抗体CDR3区展示生存素N端表位的方式,探索纳米抗体在抗原表位展示中的作用。方法:通过基因合成方法将生存素N端起始表位(氨基酸序列1~15)插入纳米抗体CDR3区,再构建到原核表达载体pET24a中,IPTG诱导表达,用带His标签的填料纯化,获得高纯度的目的蛋白,免疫雌性BALB/c小鼠,间接ELISA检测5次免疫后的效价,用抗原偶联纯化介质纯化免疫多抗,Western印迹检测多抗特异性。结果:IPTG诱导后,目的蛋白主要以包涵体形式存在,亲和层析获得纯度大于96%的目的蛋白,包涵体经复性后免疫小鼠,效价可达1∶512000,West?ern印迹特异性检测显示免疫多抗能够特异性结合生存素。结论:纳米抗体CDR3区生存素抗原N端表位展示的方法可用于抗生存素抗体的制备,并为今后纳米抗体表位展示相关研究奠定基础。     

Bt Cry毒素抗虫模拟物靶向创新设计

Bt Cry毒素是当前研究最深入、应用最广的生物抗虫蛋白，对农业害虫的绿色防治发挥了重大作用。然而，随着其制剂和转基因抗虫作物的广泛应用，由此驱动诱发的靶标害虫抗药性及潜在生态安全风险等问题日益凸显。探寻具备模拟Bt Cry毒素杀虫功能的新型抗虫蛋白材料，不仅可为农作物持续健康生产保驾护航，也能在一定程度上缓解靶标害虫对Bt Cry毒素的抗药性压力。近年来，笔者团队以抗体“免疫网络学说(immune network theory)”中Ab2β类型抗独特型抗体(anti-idiotype antibody, Anti-Id)具备模拟抗原结构和功能的特性为理论依据，借助噬菌体展示抗体库及特异性抗体高通量筛选与鉴定技术，设计Bt Cry毒素抗体为包被靶点抗原，从噬菌体抗体库中靶向筛选到了一系列具备模拟Bt Cry毒素抗虫功能的Ab2β类型抗独特型抗体(即Bt Cry毒素抗虫模拟物)，其中活性最强的Bt Cry毒素抗虫模拟物对靶标害虫的致死率接近相应原Bt Cry毒素的80%，初步实现了Bt Cry毒素抗虫模拟物的靶向设计。本文从理论依据、技术条件、研究现状等方面进行系统概述，并就相关技术发展...     

抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立

目的 制备多种抗猪鼻支原体的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA方法用于该病原体的检测。方法用猪鼻支原体CVCC361免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术和酶联免疫吸附实验筛选出抗该病原体的单克隆抗体;运用免疫双向扩散试验、Western blotting确定I异G亚类及针对抗原的相对分子质量;筛选出配对抗体,建立双抗体夹心ELISA的检测方法,并评价其灵敏度和特异性。结果共筛选出17株单克隆抗体,抗体亚类分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3,免疫印迹结果表明单抗ZB1、ZB2及ZB16与相对分子质量为35×103的抗原有特异性结合,而ZB3和ZBIO与相对分子质量为70×10^3的抗原有特异性结合。确定了2个配对抗体（ZB1-ZB1-HRP和ZB1-ZB2-HRP）,可检出最小抗原量为30ns／mL,检出猪鼻支原体活菌8．34×10^2CFU／mL,与人呼吸道常见的致病菌及支原体均无非特异性反应。结论筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,应用双抗体夹心ELISA方法可用于猪鼻支原体的检测。     

用抗独特型单抗体外诱发抗天花粉蛋白的二次抗体应答

在前阶段工作中已获得16个抗天花粉蛋白的单抗。用其中的一个IgE类单抗TE 1免疫Wistar大鼠,通过大鼠-小鼠杂交瘤技术得到了抗独特型单抗。现研究抗独特型单抗AId 6c5在体外诱发二次抗体应答中所起的作用。实验结果表明:1.当将AId 6c5和天花粉蛋白初次免疫8周后的小鼠脾细胞和肠系膜淋巴结细胞一起培养时,能引起二次抗体应答,说明AId 6c5能代替抗原的刺激作用,如果培养系统中同时存在AId 6c5和天花粉蛋白(其剂量能引起体外二次抗体应答),则可出现某种程度的抑制。由于AId 6c5是单克隆抗体,提示一种AId能在不同情况下起刺激或抑制作用。3.应用竞争结合试验阐明AId 6c5除和TE 1外,还和另外两个单抗——TE 4(IgE)和2 A1(IgG1)——起反应,先前的工作证明这三个单抗和另外4个单抗都识别天花粉蛋白上的同一抗原决定簇。但AId 6c5对识别这同一决定簇的其余4个单抗反应很弱。以上说明a.IgE和其它Ig类别具有共同或交叉的独特型,b.也说明识别同一决定簇的IgE具有不同的独特型。4.将TE 1等三个单抗和AId 6c5预先作用后能抑制这三个单抗和天花粉蛋白的结合,说明AId 6c5所识别的独特型,位于抗原结合部位内,至少??是很靠近抗原结合部位的。