表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6的一组基因的克隆

人源毒素源性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.Coil ETEC)是引起婴幼儿及旅游者腹泻的主要致病菌。ETEC的致病因子包括定居因子抗原 (Colonization factor antigens,CFAs)和肠毒素。大多数ETEC菌株均能产生抗原特异的菌毛,介导细菌与宿主小肠粘膜表面并在粘膜表面上受体的结合,使得细菌能定殖于粘膜表面并在粘膜的功能性清除中存活下来。已经报道的定居因子抗原包括CFA/Ⅰ,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅲ、CFA/Ⅳ(PCF8775)、PCF09和PCFO159等。CFA/Ⅰ和CFA/Ⅲ均由单一的菌毛亚基构成,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅳ则由多种表面抗原(colisurface antigen,CS)复合而成。所有的CFA/Ⅳ阳性菌株均表达CS6抗原,其中有些同时表达CS4或CS5抗原。CS4和CS5都是直径6～7nm的菌毛,能引起人和牛血红细胞的甘露糖抗性的凝集反应(MRHA)。迄今为止,没有观祭到CS6明显的菌毛结构,CS6也不能引起MRHA阳性反应。然而动物实验的结果表明,CS6是CFA/Ⅳ复合抗原中一种对定居作用最重要的抗原”,。本研究组已经通过分子克隆的手段获得了能分别表达CFA/Ⅰ和CS3抗原的重组菌株,用于人源ETEC疫苗的研究。本文报道了表达CS6菌毛抗原的DNA片段的克隆,并用免疫吸附制备的CS6抗血清测定了重组菌株表达的菌毛蛋白。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CFA/Ⅰ和CS6在减毒福氏志贺氏菌中的共表达

定居因子CFA/I和CS6是肠毒素大肠杆菌 (ETEC)中重要的两种优势抗原 ,是ETEC疫苗研制的首选组分。采用基因重组技术将二者构建在以asd基因为选择标记的重组质粒上 ,与asd基因缺失突变型减毒福氏志贺氏菌FWL0 1构成宿主 载体平衡致死系统。实验结果表明 ,重组疫苗候选株能够稳定表达CFA/I和CS6抗原 ,并可在菌体表面形成相应菌毛。重组菌口服免疫BALB/c小鼠后 ,可诱生相应的抗CFA/I和CS6的特异性血清抗体IgG和分泌型抗体sIgA ,说明以志贺氏菌为载体 ,可以构建同时表达多个定居因子抗原的ETEC多价菌苗     

肠毒素大肠杆菌定居因子CFA／I和CS6在减毒福氏志贺氏菌中的共表达

定居因子CFA／I和CS6是肠毒素大肠杆菌(ETEC)中重要的两种优势抗原,是ETEC疫苗研制的首选组分。采用基因重组技术将二者构建在asd基因为选择标记的重组质粒上,与asd基因缺失突变型减毒福氏志贺氏菌FWL01构成宿主．载体平衡致死系统,实验结果表明,重组疫苗候选株能够稳定表达CFA／I和CS6抗原,并可在菌体表面形成相应菌毛。重组菌口服免疫BALB／c小鼠后,可诱生相应的抗CFA／I和CS6的特异性血清抗体IsG和分泌型抗体sIgA．说明以志贺氏菌为载体．可以构建同时表达多个定居因子抗原的ETEC多价菌苗。     

CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

定居因子抗原(CFA)是肠毒素大肠杆菌(ETEC)的重要毒性因子和保护性抗原,大多以菌毛的形式存在。此类抗原的表达及菌毛的装配需要2类基因的共同作用,即亚基结构基因和辅助蛋白结构基因。亚基是纤毛抗原的基本组成单位,而辅助蛋白则参与亚基蛋白分子的输送及装配过程。CS3亚基结构基因位于辅助蛋白结构基因的下游,处于CS3操纵子的3′端。CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析揭示,在其翻译起始位点的上游存在着rbs位点及原核     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS3和肠毒素融合抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的共表达

不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）是产肠毒素大肠杆菌的主要致病因素,CS3为该菌的优势定居因子,是定居因子CFA/Ⅱ菌毛抗原的共有抗原组分。采用基因操作技术将编码CS3和融合肠毒素蛋白基因转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗侯选株X4072中进行表达。用重组菌株口服免疫小鼠后,免疫动物能产生抗CS3、LT和ST的血清抗体。特别有意义的是,所产生的抗ST抗体能中和天然ST的生物活性。这一结果为研究载体疫苗防治肠毒素大肠杆菌腹泻疾病奠定了基础。     

裂果薯皂苷的特征图谱及总皂苷中有效组分的抗肿瘤活性研究

采用高效液相色谱紫外及蒸发光散射检测器建立裂果薯总皂苷(SFSP60%)的特征图谱,乙腈-水为流动相梯度洗脱,检测波长203 nm,柱温30℃,流速1 m L/min,进样量10μL。以ELSD色谱图中SFSP60%色谱峰为参照,采用面积归一法计算出裂果薯皂苷Ⅰ(SPHSⅠ)相对百分比为84.28%,裂果薯皂苷Ⅱ(SPHSⅡ)为3.02%,化合物1为2.21%,化合物2为6.31%,化合物3为2.73%,化合物1~3可能是母核类似的皂苷类化合物。取对数生长期的人肝癌SMMC-7721细胞,给药组分别加入0、0.25、0.5、2、4μg/m L的SFSP60%、SPHSⅠ、SPHSⅡ和SPHSⅠ+Ⅱ(SPHSⅠ和SPHSⅡ各占比96.54%、3.46%)培养24 h、48 h、72 h,采用MTT法观察并计算细胞增殖抑制率和IC50。结果显示给药组对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用呈现时间与剂量依赖性(P均0.05),且活性大小:SFSP60%SPHSⅠ、SPHSⅡSPHSⅠ+Ⅱ。证明在总皂苷中是SPHSⅠ和SPHSⅡ发挥主要抗肿瘤作用,且抗肿瘤作用是各组分共同作用的结果。为裂果薯中有效组分的抗肿瘤活性研究提供了参考以及有效组分的合理配比提供了新思路。     

产肠毒素原性E.coli菌苗的研究进展

<正> 产肠毒素原性大肠杆菌(ETEC)是当前世界上的一个重要病原,虽然确切的调查资料尚难以得到,但据近来的研究估计,全世界每年大约有4亿腹泻病例,五岁以下儿童因之死亡的有70万。ETEC也是旅游者腹泻的一个重要病因。由于人们对这种病原的认识相当晚,因而近十年来才注意其菌苗的研制。 关于ETEC腹泻的致病机理常有评述,但简要说来,ETEC引起腹泻需要有两类毒力因子,即定居因子和肠毒素。病原体必须首先粘附到小肠的近测,这一过程是由称为定居因子抗原(CFA)的纤毛蛋白粘附素(adhesins)介导的。已经识别出许多这样的因子如CFA/I,CS1,CS2,CS3,CS4,CS5,CS6以及PCFO159:H4。早期的报     

舟山眼镜蛇毒抗肿瘤有效组分分离及其抑瘤作用研究初探

目的从舟山眼镜蛇(Naja atraCantor)蛇毒(snake venom,SV)中分离得蛇毒组分,探讨SV及其分离组分的LD50和抑制肿瘤的作用。方法采用凝胶柱层析方法从蛇毒中分离得到了前Ⅰ1、Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅲ1、Ⅲ2及Ⅳ等7种组分。采用急性毒性实验、MTT法,研究SV及其7种SV分离组分的LD50和抑制肿瘤的作用。结果 SV经Sephadex G-50层析,可分离为前Ⅰ、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ5个组分,根据峰面积大小排列:ⅢⅡⅠⅣ前Ⅰ。5个组分再经Sephadex G-25柱层析,可获得7个脱盐组分:前Ⅰ1、Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅲ1、Ⅲ2及Ⅳ。通过急性毒性实验,明确Ⅳ的毒性最大,其次为Ⅲ2及Ⅲ1,三者的LD50值均低于SV;而Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅱ2的毒性均小于SV,前Ⅰ1几乎无毒。SV组分Ⅲ2和Ⅳ的抑瘤作用最强,在高浓度(20μg/ml)时对实验中的2种人肿瘤细胞的抑制率均达到60%以上。结论从SV中分离得到了前Ⅰ1、Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅲ1、Ⅲ2以及Ⅳ7种组分;组分Ⅳ毒性最强,依次为Ⅲ2Ⅲ1SVⅡ2Ⅱ1Ⅰ1前Ⅰ1;SV及其7种分离组分对2种人肿瘤细胞株(SGC-7901、A549)的生长抑制有一定的特异性,而不同的SV分离组分对同一肿瘤细胞抑制作用亦有差异。     

肠毒素大肠杆菌CS3定居因子抗原和融合肠毒素基因在减毒痢疾杆菌中的共表达

肠毒素和定居因子抗原 (CFAs)是肠毒素大肠杆菌 (ETEC)两种主要的致病因素。有效的ETEC疫苗应包括这两种成分。采用基因重组技术 ,将定居因子CFA/II的共有抗原成分CS3菌毛抗原和LT B/ST融合肠毒素基因克隆至以asd基因为选择标记的重组质粒上 ,与asd基因剔除的弗氏志贺氏菌Fwl0 1构成了宿主 载体平衡致死系统。结果表明 ,在无抗生素条件选择的情况下 ,该重组菌可稳定表达CS3菌毛抗原和LT B/ST融合肠毒素抗原。通过口服和鼻饲方式免疫小鼠 ,可诱生相应的血清IgG抗体 ,同时能够检测到分泌型IgA的产生 ,表明该重组菌可以有效的诱导产生粘膜免疫。     

蚯蚓纤溶酶组分的抗原性分析

  用热变性蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolitic enzyme,EFE)组分EfP-0-2、EfP-Ⅰ-1、EfP-Ⅱ-1, 以及重组蛋白EfP-Ⅲ-2为抗原,免疫家兔获得了抗血清,利用获得的抗血清对部分组分的免疫学同一性进行了验证.EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ的免疫双扩散反应表明,EfP-Ⅰ和EfP-Ⅱ具有部分免疫学同一性. 利用DNAMAN软件对获得的EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ、EfP -Ⅲ的蛋白质序列进行了初步分析,包括整个序列相似性比对、氨基酸组成、蛋白酶消化、抗原肽、疏水性和亲水性轮廓等,并对N端氨基酸序列进行了分析.结果表明,EfP-Ⅰ和EfP- Ⅱ具有部分免疫学同一性是由它们蛋白质序列的组成和结构决定的.     

CS3菌毛可以作为异源抗原决定簇的表达载体

CS3是肠毒素源性大肠杆菌的菌毛蛋白 ,是一种很强的免疫原 .利用CS3菌毛作为异源抗原决定簇载体 ,在计算机分析预测CS3亚基的抗原表位区、二级结构的基础上 ,运用PCR定点突变在CS3亚基结构基因中引入了SacⅡ酶切位点序列 ,插入霍乱毒素B亚基抗原表位CTP3的DNA序列 ,构建了表达CS3/CTP3的重组菌株 .电镜和免疫电镜观察证明 ,CS3/CTP3以杂合菌毛的形式存在于菌体表面 .SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示了CS3/CTP3杂合蛋白的存在 .口服和腹腔注射免疫Balb/c小鼠 ,该重组菌株可诱发抗CS3和抗CTP3的双重免疫应答 .结果表明CS3可以作为表达异源抗原决定簇的表达载体 ,可望成为研制口服粘膜免疫多价疫苗的新型系统     

CS3菌毛可以作为异源抗原决定簇的嵌合表达载体

CS3是肠毒素源性大肠杆菌的菌毛蛋白,是一种很强的免疫原。研究了利用CS3菌毛作为异源抗原决定簇载体的可能性。在计算机分析预测CS3亚基的抗原表位区、二级结构的基础上,运用PCR定点突变在CS3亚基结构基因中引入了SacⅡ酶切位点序列,插入编码霍乱毒素B亚基抗原表位CTP3的DNA序列,构建了表达CS3/CTP3的重组菌株。电镜和免疫电镜观察证明,CS3/CTP3以杂合菌毛的形式存在于菌体表面,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示了CS3/CTP3杂合蛋白的存在。口服和腹腔注射免疫Bal b/c小鼠,该重组菌株可诱发抗CS3和抗CTP3的双重免疫应答。结果表明CS3可以作为表达异源抗原决定簇的表达载体,可望成为研制口服粘膜免疫多价疫苗的新型系统。     

CS3抗原基因的表达及纤毛装配元件的研究

在肠毒素大肠杆菌(ETEC)的已知定居因子中,CS3是临床分离株中最常见的抗原之一。为了研究CS3纤毛装配的基本元件,绘制了CS3亚基结构基因和辅助蛋白编码区的限制酶谱。通过亚克隆的亚基基因和不同辅助蛋白基因之间的互补性表达结果,确定了CS3纤毛装配所需要的辅助蛋白的DNA功能片段。微细胞分析结果显示,CS3基因的有效表达和纤毛装配至少需要6条蛋白多肽,分子量分别为(×10~3)15、17、24、27、48和90。除了15×10~3/17×10~3的蛋白多肽为CS3亚基外,其余的蛋白多肽参与CS3亚基的转运及纤毛的装配。根据以上结果初步确定了上述相关基因的相对位置。     

绿藻假根羽藻色素-蛋白复合物的分离及其特性研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蔗糖密度梯度超速离心方法分离了假根羽藻(Bryopsis corticulans)的色素-蛋白复合物,并对其特性进行分析。结果表明:采用PAGE分离得到7条色素-蛋白复合物带,分别是CPⅠa1、CPⅠa2、CPⅠ、LHCP₁、LHCP₂、CPa、LHCP₃₊₃,和2条游离色素(free pigment,FP)FCa、FC。用改进的不连续蔗糖密度梯度离心法分离到五条带。区带Ⅰ是FP;区带Ⅱ主要是小分子量的PSⅡ捕光复合物LHCP₃₊₃;区带Ⅲ以PSⅡ捕光复合物的聚集体LHCP1为主,区带Ⅱ和Ⅲ的吸收光谱中除了Chla外,还含有大量的Chlb和管藻黄素,是管藻黄素-Chla/b-蛋白质复合物;区带Ⅳ在PAGE中只显示一条带,光谱中有Chlb吸收肩峰,含有66和56kDa两种多肽,是较小的PSⅠ复合物CPⅠa。     

出血热病毒株的分型和抗原性比较的进一步研究

本工作进一步对分离自不同来源的14株出血热病毒用空斑减少中和试验(PRNT)方法进行了分型。以不同株的家兔免疫血清对国际上血清Ⅰ型和Ⅱ型参考毒株进行试验,除分离自褐家鼠的K_(24)-株外,其余13株均可定为血清Ⅰ型或血清Ⅱ型用已知的Ⅰ型和Ⅱ型出血热高价免疫血清与K_(24)株进行中和试验,根据两型免疫血清的中和效价则可将K_(24)株定为血清Ⅱ型,但是K_(24)株免疫血清对6株Ⅰ型病毒和4株Ⅱ型病毒的中和效价几乎相同(相差≤2倍),表明K_(24)株是一株具有广谱中和抗原的出血热病毒。     

里氏木霉纤维素酶的分离纯化及酶学性质

通过(NH4)2SO4分级沉淀、HiPrep 26/10 Desalting凝胶色谱脱盐、Source 15 Q阴离子交换色谱技术,里氏木霉(Rut C-30)纤维素酶主要组分得以初步分开,再经过Source 15 S阳离子交换色谱、HiPrep Sephacryl S-100 HR凝胶过滤色谱、Superdex 75 PrepGrade凝胶过滤色谱进一步分离纯化,得到2个纯化的内切葡聚糖酶组分EGⅡ、EGⅠ和一个外切葡聚糖酶组分CBHⅠ;经过SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯,测得相对分子质量分别为5.22×104,5.62×104和6.90×104。EGⅡ的最适反应pH是5.6,最适反应温度为65℃;EGⅠ的最适反应pH是4.4,最适反应温度为55℃;以羧甲基纤维素(CMC)为底物时,EGⅠ、EGⅡ的米氏常数(Km)分别为2.20 mg/mL、3.38 mg/mL。CBHⅠ的最适反应pH是5.8,最适反应温度为60℃,以对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(PNPC)为底物时,米氏常数(Km)为0.12 mg/mL。     

中国人dystrophin基因RFLPs的初步研究

我们用dystrophin基因的cDNA全顺序(长14 kb)为核酸分子杂交探针,对中国人dystrophin基因内的RFLPs进行了初步研究。在结果中给出了PvuⅡ/1 a、Taq Ⅰ/2 b—3、PvuⅡ/2 b—3、TaqⅠ/5 b—7、Xba Ⅰ/10五种杂交中所见的六个RFLPs 的预期杂合频率和受检女性的实际杂合频率;其中PvuⅡ/2 b—3(A 1=26.0 kb,A 2=3.8 kb)和Taq Ⅰ/5 b—7(A 1=10.0 kb,A2=8.4 kb)的2个RFLPs为本文首次报道。PvuⅡ/1 a的2个RFLPs 的等位片段频率与日本人的同类研究结果比较,差异无显著性。但Taq Ⅰ/2 b—3、Taq Ⅰ/5 b—7、Taq Ⅰ/8、EcoR Ⅴ/9和Xba Ⅰ/10的5个RFLPs 与高加索人的数据比较,发现其中4个RFLPs 的等位片段频率的差异有极其显著性。这提示了东西方人在dystrophin 基因的分子结构上存在着较大的差别。在这些差异之中,Taq Ⅰ/2 b—3、Taq Ⅰ/8和EcoR Ⅴ/9检出的RFLPs 等位频率,中国人低于高加索人;而Xba Ⅰ/10检出的RFLPs 等位频率则显著高于高加索人;另外Taq Ⅰ/5 b—7检出的RFLPs的等位片段频率则与高加索人相近。实验结果还提示PvuⅡ/1 a、Taq Ⅰ/5 b—7和Xba Ⅰ/10这三种杂交,对于在中国人群中检测DMD/BMD 基因携带者以及产前诊断,具有很高的应用价值。     

单次运动对缺氧诱发心肌自噬反应的影响

为研究运动后不同休息时间对间歇性低氧诱发心肌自噬反应的影响,本研究将8周龄Sprague-Dawley雄性大鼠,随机分成控制组(control group, CON)、运动组(exercise group, EXE)、间歇性低氧曝露组(intermittent hypoxia group, IH)、空气曝露组(room air group, RA)、运动后1 h (post-exercise 1 h, PE1h)和3 h (PE3h)合并RA或IH组。大鼠给予单次持续8 h IH (氧气浓度下降至2%～6%约1～2 s/75 s),单次运动方式以速度24 m/min、坡度2%的强度在动物跑台上跑步60 min。动物牺牲后,检测左心室心肌糖原、自噬反应相关蛋白及腺粒体功能相关m RNA表达量。研究发现,运动后心肌细胞微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ, LC3-Ⅱ)/LC3-Ⅰ表达量、糖原含量下降(p0.05),p62表达量没有变化(p0.05)。IH对心肌p62表达量没有影响(p0.05),与RA比较,IH的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、核内呼吸因子1和2 (nuclear respiratory factor 1 and 2, NRF-1和NRF-2) m RNA表达量上升(p0.05)。与IH比较,PE1h+RA、PE3h+RA及PE3h+IH各组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NRF-1和NRF-2 m RNA表达量均下降(p0.05),虽然PE1h+IH的NRF-1和NRF-2 mRNA表达量下降(p0.05),但LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达量没有改变(p0.05)。本研究说明,IH曝露前3 h进行运动,可避免IH造成心肌LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达量上升的现象。     

不同基因型戊型肝炎病毒存在多种类型抗原表位

以戊型肝炎病毒(HEV)ORF2重组蛋白p166Us为免疫原制备单克隆抗体(McAbs),采用间接ELISA和免疫印迹法,检测McAbs与不同基因型和亚型HEV重组蛋白p166Bur(Ⅰa型)、p166Pak(Ⅰb型)、p166Mor(Ⅰc型)、p166Mex(Ⅱ型)、p166Us(Ⅲ型)、p166Nz(猪HEV,Ⅲ型)和p166Chn(Ⅳ型)的反应性,采用抗原或抗体竞争ELISA分析p166蛋白与天然HEV颗粒之间抗原表位的关系。结果获得4D3、2E3、11E11、12H5、3A3和1F16株稳定分泌McAbs的杂交瘤细胞株。4D3分泌的McAb与7种p166均发生反应,其与免疫原p166Us的结合可被Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ型天然HEV颗粒或病人血清竞争抑制。2E3、11E11和12H5分泌的McAbs只与p166Us、p166Nz和p166Chn发生反应,它们与p166Us的结合仅能被Ⅲ和IV型病毒或血清所抑制。3A3分泌的McAb只与p166Us及p166Nz结合,1F1分泌的McAb只与p166Us结合,两者均能被Ⅲ型美国株竞争抑制,而Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型不能抑制它们与p166Us的结合。由此可见,不同基因型和亚型HEV ORF2编码蛋白p166上存在多种类型抗原表位,其中包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ基因型共同的,Ⅲ、Ⅳ基因型共有的和第Ⅲ基因型特异的等,这些表位与天然HEV颗粒上的抗原表位具有相同的免疫学特征。     

玉米大斑病菌特异性毒素组分分离条件的优化研究*

把从玉米大斑病菌的1号小种菌株（99．2）中提取的粗毒素进行硅胶TL层析,分离到Ⅰ（Rf0．06）、Ⅱ（Rf0．21）、Ⅲ（Rf0．d5）、Ⅳ（R,0．60）、Ⅴ（Rf0．75）5种组分,分别对此5组分进行生物测定,发现组分Ⅱ对带Ht1基因的玉米具有较强的特异性。经对组分Ⅱ进行HPLC的进一步纯化,又可得到3种组分Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3,其中只有Ⅱ-3具有特异致病活性。对Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3进行紫外．可见全波长扫描,发现只有Ⅱ-3在300nm处有吸收峰,Ⅱ-1和Ⅱ-2的峰形相似,可能为类似物。