猪成纤维细胞细胞周期同期化对核移植胚胎发育的影响

供体细胞所处的细胞周期及细胞周期同期化的方法对于体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）的成功非常重要,本研究对血清饥饿培养处理与培养至完全汇合后的猪成纤维细胞周期同期化水平进行了检测。利用不同方法对猪成纤维细胞同期化处理后,通过流式细胞仪对细胞的细胞周期分布比率进行了检测。将细胞进行血清饥饿24⁷2h,显著地增加了G₀/G₁期的细胞百分率（92.2%⁹3.7%vs.77.8%,P<0.05）。将细胞培养至完全汇合后再培养24⁴8h,G₀/G₁期的细胞比例类似于血清饥饿法（94.4%,89.6%）。血清饥饿24h后,置换为10%FBS能逆转至生长期。用这两种不同方法处理后的体细胞作为核移植的供体构建重构胚,分裂率与囊胚率差异不显著（P>0.05）。结果表明,猪成纤维细胞通过血清饥饿法或者培养至汇合完全均能有效地将细胞周期同期化至G₀/G₁期,且均可作为体细胞核移植的供体细胞。     

奶山羊转基因供核细胞的再饥饿对核移植胚胎发育的影响

为提高转基因奶山羊体细胞核移植胚胎早期发育率,将经转染外源基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿培养(含0.5?S的DMEM)5天后分成两部分:第一部分细胞-80℃或液氮冻存,试验前复苏后直接用作供核细胞(试验组Ⅰ),或复苏后恢复培养(含10% FCS的DMEM)2-5天后再饥饿5天用作供核细胞(试验组Ⅱ);第二部分细胞作传代培养(含10% FCS的DMEM)2天后再饥饿5 天用作供核细胞(试验组Ⅲ)。将上述不同处理的供核细胞进行细胞周期与存活率的检测,并将该供核细胞移入去除遗传物质的山羊MⅡ期卵母细胞的卵周隙内,经电融合、化学激活后,将核移植(NT)胚胎经0.8%琼脂糖包理后移入临时寄母输卵管内,培养6天后回收并观察NT胚胎的早期发育。结果,试验组Ⅱ所用供核细胞中G_0/G_1期细胞所占比例及其存活率分别为95.68%、99.9%,均显著地高于试验组Ⅰ(88.66%、80%);试验组Ⅱ的桑椹及囊胚期NT胚胎的发育率(66.09%)显著地高于试验组Ⅰ(22.00%)与试验组Ⅲ(50.51%)。将以上发育的NT胚胎分别移入同步发情的受体后,35 天作B超妊娠诊断,试验组Ⅱ的受体妊娠率为45.83%,显著地高于试验组Ⅰ(20.00%)与试验组Ⅲ(9.58%)。流式细胞仪分析结果表明,饥饿后的供核细胞经冷冻,复苏后恢复培养2-5天,再经饥饿处理,能显著地提高G_0/G_1期细胞的比例及细胞存活率;应用该细胞所组建的NT胚不仅具有较高的桑椹与囊胚期发育率,而且具有较高的受体妊娠率。     

源自睾丸精子冻融胚胎卵裂球完整性及恢复卵裂对生育结局的影响

目的:探讨源自睾丸活检或睾丸显微取精形成的胚胎冷冻复苏后卵裂球完整性及是否恢复卵裂与生育结局的关系。方法:回顾性分析658个冻融胚胎移植(FET)周期,根据精子来源将其分为手淫精子组(ICSI组)445周期,睾丸活检或睾丸显微取精组(TESA组)213周期。ICSI组根据复苏2枚胚胎后完整个数(0、1、2枚)分为3组(A、B、C组),TESA组也据此分为D、E、F组。ICSI组根据2枚胚胎复苏后恢复卵裂个数(0、1、2枚)分为3组(G、H、I组),TESA也据此分为J、K、L组。综合比较各组之间的生育结局。结果:①ICSI组与TESA组复苏后胚胎完整率、复苏18-20 h后胚胎卵裂率、种植率、临床妊娠率、活产率、分娩孕周及出生体重比较差异无统计学意义(P0.05)。但ICSI组早期流产率显著高于TESA组。②ICSI中B组与C组上述妊娠结局指标比较差异无统计学意义(P0.05),但种植率、临床妊娠率、活产率均显著高于A组(P0.05)。TESA三个亚组比较无统计学差异(P0.05)。ICSI与TESA组间比较差异无统计学意义(P0.05)。③ICSI中I组种植率、临床妊娠率、继续妊娠率均显著高于H组(P0.05),且I组与H组均显著高于G组(P0.05)。I组活产率显著高于G组和H组(P0.05)。TESA中L组种植率、临床妊娠率、继续妊娠率、活产率均显著高于J组(P0.05)。ICSI与TESA组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:尽管睾丸活检或睾丸显微取精的精子质量较差,但一旦形成有效胚胎,FET结局与手淫精子来源的胚胎并无差异。至少移植一枚完整胚胎较移植两枚均破损胚胎具有更好的生育结局。至少移植一枚恢复卵裂的胚胎较两枚均不卵裂胚胎具有更好的生育结局。解冻后无完整胚胎且过夜培养后又均未恢复卵裂的胚胎应慎重考虑该周期是否取消移植。     

小鼠2,4,8—细胞胚胎卵裂球体外培养的研究

以ＣＺＢ为基础培养液,培养小鼠２、４、８－细胞胚胎的卵裂球,研究葡萄糖、牛磺酸和胰岛素对１／２卵裂球体外发育的影响及１／４、１／８和２／８卵裂球的体外发育规律。２－细胞胚胎卵裂球在ＣＺＢ中和在添加牛磺酸的ＣＺＢ中培养,其囊胚发育率（分别为９２％、８９％）无显差异（Ｐ＞０．０５）。胰岛素在少量葡萄糖存在的情况下,不影响卵裂球的囊胚发育率;在无葡萄糖时,卵裂球的囊胚发育率（３８％）显降低。牛磺酸在     

哺乳动物核移植中供核与受体卵胞质细胞周期的相互关系

就供核与受体卵胞质细胞周期的相互关系问题进行了综述.核移植技术不管是在基础理论,还是在应用研究中都具有广泛的应用价值,但核移植的效率却很低,其根本原因是与核移植相关的许多基础理论问题尚不清楚,对这些问题的研究发现,维持重构卵核的正确倍性,并使其重新程序化是核移植成功的关键,不同的胞质受体及不同的供体细胞及其状态均对重构胚的发育有影响.     

鱼类体细胞移核胚胎发育影响因素的探讨

将脱膜后的泥鳅 (Misgurnusanguillicaudatus)受精卵置于不同孵化液中孵化 ,结果表明 ,孵化液 1×Holtfreter中正常鱼苗和总鱼苗的孵化率最高 ,分别为 5 4 8%和 5 9 2 %。 1/ 2×Holtfreter、 1/ 10×Holtfreter、曝气冷开水和改变孵化液处理 ,正常鱼苗的孵化率差别不大 ,分别为 48 0 %、 49 6 %、 5 0 0 %和 48 8%。曝气冷开水畸形率最高 ,为 8 8%。PBS不适合用作孵化液。机械损伤对胚胎的孵化率无明显影响 (73 39%vs 75 70 % ) ,但对胚胎发育有明显的致畸作用 (8 0 6 %vs 0 )。以雌核发育鳙 (Aristichthysnobilis)尾鳍培养细胞作供体 ,泥鳅未受精卵作受体 ,微卫星标记分析表明 ,移核胚胎的核来源于供体核 ,受体卵中未除去的核被排斥。供体细胞培养代数严重影响移核胚胎的发育率。随着培养代数的增加 ,移核胚胎的发育率逐渐降低。继代核移植可提高移核胚胎的发育率 ,尤其是第 1次体细胞继代核移植 ,晚期囊胚的发育率急剧上升 (4 3 84%vs 7 6 9% ) ,说明继代核移植可促进受体卵对供体核的再程序化。泥鳅和大鳞副泥鳅 (Paramisgurnusdabryanus)未受精卵作受体 ,其移核胚胎发育率无明显区别 (7 6 9%vs 7 0 2 % )。     

牛供体细胞的来源、血清饥饿和预激活对核移植卵体外胚胎发育的影响

牛皮肢成纤维细胞经血清饥饿或预激活处理后获得核胞体,并注入去核卵母细胞内构建重组胚。检查重组胚24h和36h卵裂率以及8d囊胚率,以评估供体细胞及其处理方法对体细胞核移植效果的影响。实验结果表明：来自3个年龄（6、18和36月龄）、2个品系（红安格斯肉牛和荷斯坦奶牛）的4头供体牛皮肤细胞重组胚的卵裂率和囊胚率均无差异。生长到完全汇合的36月龄荷斯坦牛供体细胞血清饥饿10-13d组重组胚的36h卵裂率显著低于0d（对照）、3-5d和6-9d组,囊胚率显著低于3-5d组;经5μmol/L离子霉素或7％乙醇预激活5min重组胚的卵裂率和囊胚率均与对照组无差异。     

小鼠2-细胞胚胎单个卵裂球体外培养及其发育形成囊胚的玻璃化冷冻保存技术的研究

单个卵裂球分离和培养是生产同卵双胎或一卵多胎动物的一种有效方法。在羊和牛已经获得了来源于2-细胞和4-细胞期胚胎的单个卵裂球的活体后代;在兔也获得来源于4-细胞胚胎的单个卵裂球后代;在猪已获得8-细胞单个卵裂球的后代。但多数的研究者发现,小鼠单个卵裂球培养后的体外发育率、移植妊娠率和产仔率都很低。上述均为新鲜胚移植结果,至于分离后卵裂球发育成的囊胚再进行玻璃化冷冻保存尚未见报道。本实     

体细胞的组织来源及培养代数对猪核移植重构胚发育的影响

本研究系统探讨了体细胞的组织来源及培养代数对猪核移植重构胚发育的影响。体外成熟培养40-44h的猪卵母细胞去核后,将经血清饥饿(0．5?s)培养2-9d、0．1mg/L Aphidicolin (APD)培养 0．5?S培养2-9d或一般培养法(10?S)培养的卵丘细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞,直接注射到去核的卵母细胞质中,或注射到卵周隙中。再经电融合(100V/mm,30μs,电脉冲1次)构建重构胚。重构胚以钙离子载体A23817或电脉冲结合6- DMAP激活处理,体外培养6天。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0．1mg/L APD 0．5?S培养处理后的重组胚卵裂率,均高于血清饥饿和一般培养处理的同种供体细胞(P＜0．01)。卵丘细胞、颗粒细胞经0．1mg/L APD 0．5?S处理后进行核移植的分裂率和发育率均高于输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞(P＜0．05)。以猪颗粒细胞为核供体时,电融合法的重构胚分裂率显著高于胞质内注入法(P＜0．05),但囊胚发育率无显著差异(P＞0．05)。培养3代和6代的猪颗粒细胞以及培养6代和10代的耳皮成纤维细胞,其具有正常二倍染色体的细胞比例均无显著差异(P＞0．05);以这2种细胞不同培养代数做供体进行核移植时,各代之间核移胚的体外分裂率、囊胚发育率无显著差异(P＞0．05)。这些结果表明：(1)猪耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经培养传代所建立起来的细胞系相对比较稳定;(2)0．1mg/L APD预培养处理供体细胞能提高猪体细胞核移植的效果,血清饥饿培养则无明显效果;(3)猪颗粒细胞和耳皮成纤维细胞等均可做供核细胞．核移植后都能得到体细胞克隆的囊胚,但前者的效果略优于后者,且其核移植效果不受供核细胞培养代数的影响;(4)电融合核移植胚胎的发育率高于胞质内直接注入法,但两者的总体效率相近。     

鼠兔核质杂交胚胎早期发育的研究

细胞核移植技术已被证明是研究发育中核质相互关系的非常重要的手段之一,电融合技术也是近十年发展起来的新型细胞融合技术。本实验运用这两项技术,进行了鼠、兔目间核质杂交实验,小鼠8-细胞核在激活的兔去核卵母细胞中,发生了染色体超前凝聚及核膨胀,融合卵移植到小鼠输卵管4.5天后,冲洗出,有5.4%的重构卵发育到囊胚期,通过染色体检查,囊胚细胞中均为小鼠染色体,其中一个囊胚为正常小鼠核型(2 n=40,XX)。通过本实验,我们认为:鼠兔远缘核质杂交胚胎的早期发育是可能的。     

金黄仓鼠早卵裂期胚胎发育的研究

研究结果证明:(1)本研究制备和采用的金黄仓鼠(Mesocricetus aurilus)血清是体外培养金黄仓鼠胚胎的有效成分;(2)丙酮酸钠和乳酸钠加入TC-199液中可显著提高金黄仓鼠胚胎的发育率;(3)TC-199(Ⅱ)、台氏液和杜氏液加适量FCS或PHS都是培养金黄仓鼠胚胎的有效培养液;(4)本研究中已观察到4-细胞期胚胎在体外培养时的进一步发育;(5)金黄仓鼠2-细胞期胚胎移植至雌金黄仓鼠受体的输卵管中可继续发育,培养子兔输卵管中可存活44小时以上。     

兔核移植胚胎起始发育的超微结构研究

对兔核移植胚胎起始发育的超微结构变化进行电镜观察,并与供体桑椹胚细胞,受体卵母细胞及同期正常受精胚胎的超微结构进行比较,“原核”期兔核移植胚胎的超微结构明显不同于供体桑椹胚细胞及受体卵母细胞的超微结构,而与同期正常受精胚胎相似,但有些核移植胚胎中皮质反应,及核仁和线粒体中出电子致密的网眼结构,与正常受精卵存在差别,分裂至２－细胞期时,与正常２－细胞胚超微结构更相似,结果提示,兔胚胎细胞核移植后,供     

缺血缺氧对体外培养星形胶质细胞细胞活化和细胞周期的影响

目的观察缺血缺氧损伤对星形胶质细胞细胞活化和细胞周期的影响。方法用流式细胞仪及BrdU掺入法检测缺血缺氧后不同时间点星形胶质细胞细胞周期变化和细胞的增殖活力;用荧光免疫细胞化学技术测定胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)及细胞周期蛋白cyclinD1的表达水平。结果体外缺血缺氧损伤后星形胶质细胞S期较正常组明显增高,6h达高峰,BrdU掺入法显示损伤后6h星形胶质细胞的增殖活力最高,而随后S期细胞数目及细胞增殖活力都呈下降趋势。在缺血缺氧早期,GFAP阳性染色增强,6h最高;缺血缺氧12h后GFAP阳性染色变弱,而cyclinD1的表达在损伤后逐渐增加,在24h时达高峰。结论缺血缺氧损伤激活星形胶质细胞,使其进入新的细胞周期,出现细胞的增殖反应;cyclinD1参与了损伤后星形胶质细胞的修复和增殖;细胞周期事件与星形胶质细胞的增殖活化密切相关。     

三氧化二砷诱导CNE1凋亡及其对细胞周期的影响

目的 研究三氧化二砷对人鼻咽癌CNE1细胞凋亡及其细胞周期的影响。方法 应用形态学观察、原位末端标记法(TUNEL)、流式细胞术等方法对三氧化二砷诱导的鼻咽癌细胞CNE1进行检测和观察。结果 一定浓度三氧化二砷能诱导CNE1细胞凋亡,凋亡细胞具有典型的凋亡形态特征,TUNEL原位检测有典型凋亡细胞,流式细胞仪检测有凋亡峰,G2／M期比例升高,呈一定的剂量效应关系。结论 三氧化二砷能诱导人鼻咽癌CNE1细胞株凋亡及阻止细胞周期进展的作用。     

川金丝猴口腔的观察

本文对川金丝猴的口腔进行观察，发现川金丝猴牙齿前后径总的趋向是Ｉ１＞Ｉ２，Ｉ１＞Ｉ２，Ｉ１＞Ｉ１，Ｉ２＞Ｉ２，上犬齿＞下犬齿，Ｐ４＞Ｐ３，Ｐ４＞Ｐ３，Ｍ２＞Ｍ３＞Ｍ１，由于Ｍ３多一下次小尖，故Ｍ３＞Ｍ２＞Ｍ１。Ｉ１与Ｉ２大小有别，但看不到Ｉ２顶端明显变尖的迹象。犬齿的性二型主要表现在上犬齿，且主要表现于与Ｐ３、Ｐ４前后径的相对大小上。雄性上犬齿与Ｉ２的间距明显大。对金丝猴的年龄判断提出以切齿更换，咬合面形态、齿星出现，齿星形态等咬合面磨损规律的口齿鉴定法。对唇游离缘近口角处明显增厚及其性差别，腭扁桃体的大体形态作了描述。此外，对舌、腭、口腔腺也作了叙述和讨论。     

硬骨鱼类体细胞核移植的研究

本文用不同属、科、目的硬骨鱼类作材料进行体细胞核移植研究。鲫鱼（Ｃａｒａｓｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓ）、鲮鱼（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ）和尼罗罗非鲫（Ｔｉｌａｐｉａｎｉｌｏｔｉｃａ）的体细胞核（头肾细胞）移植到鲤鱼（Ｃｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ）的成熟去核卵中,通过继代核移植,在鲫鱼体细胞核和鲤鱼去核卵的属间组合中,获得发育到血液循环期的幼鱼;在鲮鱼体细胞核和鲤鱼去核卵的亚科间组合中,获得发育到心脏跳动期的晚期胚胎;在尼罗非鲫体细胞核和鲤鱼去枚卵的目间组合中,获得发育到肌肉效应期的胚胎。由于是直接用成鱼体细胞核作供核体进行核移植,因而能够克服供体鱼和受体鱼不同步产卵的困难。实验结果表明,这对进行硬骨鱼类核质杂交研究无疑是一种简便而又有效的方法。     

细胞松弛素B对人胚肺二倍体细胞SL_7和肿瘤细胞CNE、LTEP-78增殖周期的不同影响

CB(1.5微克/毫升)处理正常二倍体细胞SL_7和人肺鳞癌细胞LTEP-78及鼻咽癌细胞CNE,以~3H-TdR掺入和DNA含量变化为指标,观察十天内,核复制动态。SL_7细胞~3h-TdR掺入进行性下降至0,细胞周期被迫阻断(非时相特异性阻留),一部分细胞成为双核。肿瘤细胞LTEP-78和CNE,~3H-TdR掺入受一定程度抑制,但细胞周期移行可以持续,结果,产生一部分多核细胞和染??色体多倍化。CB引起的微丝束解聚与~3H-TdR掺入下降之间,未见到相关性。