表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST₁突变基因和LT_B基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST₁-LT_B融合基因表达载体的重组菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5）。经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST₁-LT_B融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的K88ac-ST₁-LT_B融合蛋白能够被ST₁单抗、LTB和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实,表达的融合蛋白已丧失天然ST₁肠毒素的活性。免疫实验结果表明,K88ac-ST₁-LT_B融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST₁肠毒素的毒性作用,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄、白痢基因工程菌苗的候选菌株。     

大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因表达条件的优化

目的:对已构建的含有大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的重组菌株进行鉴定和表达条件优化。方法:采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下ST1-LTB融合基因的表达情况。结果:酶切鉴定证实重组质粒pXSL1含有ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,以IPTG为诱导剂诱导ST1-LTB融合基因表达的优化条件是:培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时ST1-LTB融合蛋白表达量达35.2%。结论:实现ST1-LTB融合基因的高效表达,为大肠杆菌肠毒素双价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的实验数据。     

大肠杆菌肠毒素ST1、LTB基因融合及其免疫原性研究

目的:构建大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因,并研究其表达产物的免疫原性。方法:采用PCR和基因突变技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增ST1突变基因和LTB基因,通过基因分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株,并用酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒,同时用ST1-LTB融合蛋白粗提物免疫小鼠,观察免疫攻毒保护效果。结果:构建了含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1),ST1-LTB融合基因的序列和阅读框架均正确,其表达的ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗和LTB抗体识别,且该融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。ST1-LTB融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用。结论:构建的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1)可以高效表达ST1-LTB融合蛋白,其表达产物ST1-LTB融合蛋白具有良好的免疫原性,为更有效地预防仔猪黄痢提供了一种新型基因工程菌苗候选菌株。     

动物病原大肠杆菌K88的绿色荧光蛋白基因标记及其稳定性研究

成功地将gfp/luxAB双标记基因整合到K88染色体上,得到绿色荧光蛋白基因标记的大肠杆菌K88∶gfp/lux,其菌体和菌落形态与原始菌株K88完全一致,引入的新质粒不影响菌株的基本形态。从含gfp基因的质粒DNA和K88∶gfp/lux基因组DNA上均可扩增出大小约700 bp的gfp基因片段。大肠杆菌特异性基因检测结果表明,从大肠杆菌K88和K88∶gfp/lux基因组DNA上均扩增出大小约260 bp的大肠杆菌特异性基因片段,说明gfp基因标记后的菌株均为大肠杆菌。在相同的培养条件下,K88∶gfp/lux和K88的生长曲线的变化趋势基本相同。通过检测肠毒性基因(estA)发现,从大肠杆菌K88和K88∶gfp/lux基因组DNA上均扩增出大小约158 bp的肠毒性基因片段,说明gfp基因标记后的菌株在肠毒性方面未发生变化。在无选择压力条件下将K88∶gfp/lux菌株每隔12 h连续转接10次后,所有菌落均保持着均匀并且强烈的绿色荧光,说明标记基因在K88∶gfp/lux中的表达稳定性很高。K88∶gfp/lux和K88在中性偏酸性的环境中生长较好,当初始pH值偏碱性时,生长较差。     

毒素源性大肠杆菌K88ac抗原基因的次级克隆和重组质粒的限制图

从我国引起仔猪腹泻的野生株E. coli 79-1454克隆了K88ac抗原基因,获得了重组体E. coli RR1(pNZ8801),分子量为10 Md。为了得到分子量更小的重组体,用E．coRI消化重组质粒,除去中间约3.2 Md的片段,得到次级克隆株E. coli RR1(pNZ8802),质粒分子量为6.8 Md。测定其K 88ac抗原为阳性,而且其产生的K88at抗原量略高于初级克隆株。电镜照片表明重组体表面长有菌毛。萤光抗体染色和猪刷状缘细胞粘附试验亦表明有良好的粘附生物活性。此重组体可以与本人克隆的K99抗原基因构建成复合重组体。本文还作了重组体的限制性酶切图。     

表达ST1-LTB-a-b融合蛋白基因工程菌株的构建及其免疫原性分析

采用分子生物学技术构建了含有ST1-LTB-a-b融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pETST3LTBab), SDS-PAGE和 Western blotting分析表明ST1-LTB-a-b融合基因在大肠杆菌中得到了高效表达, 融合蛋白分子量约为110 kD; 20 L发酵罐培养得到的最佳诱导条件为: 重组菌株以1%接种量、5 L/min通气量培养3 h后加终浓度为0.03 mol/L的乳糖诱导, 通气量升至12.5 L/min继续培养6 h, 表达量占菌体总蛋白的38.53%; 表达的ST1-LTB-a-b融合蛋白无毒性但具有免疫原性, 可以抵抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的感染; 构建的重组菌株BL21(DE3)(pETST3LTBab)有望作为预防仔猪腹泻基因工程疫苗的候选生产菌株。     

MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表达载体的构建

目的：构建可高效生产甘油脱水酶的大肠杆菌工程菌,方法：将编码甘油脱水酶的三个基因gldA、gldB、gldC,分别克隆至克隆载体pMD18-T和pSIM-T中,经测序正确后,再亚克隆至表达融合蛋白的高效表达载体pMAL-c2X上,构建成表达质粒pMAL-gldABC,并转化大肠杆菌E.coli DH5α。结果：成功地将甘油脱水酶基因gldABC以同向串联方式克隆到大肠杆菌融合表达载体pMAL-c2X中,结论：得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表达载体,为研究甘油脱水酶基因（gldABC）的在原核表达载体中的串联表达奠定了基础。     

表达ST1-LTB-α-β融合蛋白基因工程菌株的构建及其免疫原性分析

采用分子生物学技术构建了含有ST1-LTB-α-β融合基因的重组菌株BL21（DE3）（pETST3LTBαβ）,SDS-PAGE和Western blotting分析表明ST1-LTB-α-β融合基因在大肠杆菌中得到了高效表达,融合蛋白分子量约为110kD;20L发酵罐培养得到的最佳诱导条件为：重组菌株以1％接种量、5L／min通气量培养3h后加终浓度为0．03mol／L的乳糖诱导,通气量升至12．5L／min继续培养6h,表达量占菌体总蛋白的38．53％;表达的ST1-LTB-α-β融合蛋白无毒性但具有免疫原性。可以抵抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的感染;构建的重组菌株BL21（DE3）（pETST3LTBαβ）有望作为预防仔猪腹泻基因工程疫苗的候选生产菌株。     

用遗传工程技术构建含E．Coil K88ac和 LT(A-B+)两种抗原基因的菌株

用我室克隆的含大肠杆菌K88ac抗原基因的pMM031质粒和含肠毒素LT(A^-B⁺)抗原基因的质粒pPMc4,使用限制性内切酶BamHI酶解,取得了K88ac抗原基因的片段,再经和BamH I消化的质粒pPmc4连接重组,构建了同时具有这两种抗原基因的质粒pMM085羟琼脂糖凝胶电泳分析,pMM085质粒的分子量约为14．6Md,在宿主菌E．CoilC600,经过ELISA和反向间接血凝等几种试验测定K88ac抗原,结果都说明其抗原产量与亲本菌株基本相同。重组菌的抗甘露糖豚鼠红细胞凝集反应也是阳性。对肠毒素抗原用被动溶血试验测定,结果说明其LT-B的产量和亲本菌的产量也基本相同。重组的工程菌株经兔肠结扎试验表明没有毒性反应,因此重组菌株可以作为预防仔猪腹泻的活菌疫苗候选株。     

大肠杆菌K88ac菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性初步研究

目的：在体外克隆和表达猪肠产毒性大肠杆菌（ETEC）K88ae菌毛操纵子,触结构基因,并检测重组菌毛的相关生物学活性。方法：利用长PCR技术以猪ETECK88ae株C83902基因组DNA为模板扩增编码K88菌毛操纵子触基因,克隆入表达质粒载体pBR322,构建和筛选重组质粒pBR322-fae,转化至不含任何菌毛的大肠杆菌EP株;电镜观察重组菌表面菌毛表达情况;用热抽提法提纯表达的重组菌毛;用纯化菌毛免疫小鼠制备高效价抗血清;用SDS-PAGE和Western blot检测重组菌毛的抗原性,用细胞黏附和黏附抑制试验检测其生物学活性。结果和结论：在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88ae菌毛,该重组菌与兔抗K88ae菌毛单因子阳性血清、鼠抗K88ac菌毛单克隆抗体均产生凝集反应;纯化菌毛经SDS-PAGE,结构单位菌毛呈单一的相对分子质量约26×10^3的蛋白条带;纯化菌毛免疫小鼠后可制备出高效价的鼠抗血清,玻板凝集试验和Western blot结果表明体外表达的K88ae菌毛具有与K88ae野生菌毛相同的抗原性;猪小肠上皮细胞系黏附和黏附抑制实验结果表明重组EP菌和野生菌株一样具有较强的黏附猪小肠上皮细胞系的能力,而且提纯重组菌毛制备出的鼠抗血清能有效抑制上述重组菌或野生菌株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。     

Recombinant plant-expressed tumour-associated MUC1 peptide is immunogenic and capable of breaking tolerance in MUC1.Tg mice

The human epithelial mucin MUC1 is a heavily glycosylated transmembrane protein that is overexpressed and aberrantly glycosylated on over 90% of human breast cancers. The altered glycosylation of MUC1 reveals an immunodominant peptide along its tandem repeat (TR) that has been used as a target for tumour immunotherapy. In this study, we used the MUC1 TR peptide as a test antigen to determine whether a plant-expressed human tumour-associated antigen can be successfully expressed in a plant system and whether it will be able to break self-antigen tolerance in a MUC1-tolerant mouse model. We report the expression of MUC1 TR peptide fused to the mucosal-targeting Escherichia coli enterotoxin B subunit (LTB-MUC1) in a plant host. Utilizing a rapid viral replicon transient expression system, we obtained high yields of LTB-MUC1. Importantly, the LTB-MUC1 fusion protein displayed post-translational modifications that affected its antigenicity. Glycan analysis revealed that LTB-MUC1 was glycosylated and a MUC1-specific monoclonal antibody detected only the glycosylated forms. A thorough saccharide analysis revealed that the glycans are tri-arabinans linked to hydroxyprolines within the MUC1 tandem repeat sequence. We immunized MUC1-tolerant mice (MUC1.Tg) with transiently expressed LTB-MUC1, and observed production of anti-MUC1 serum antibodies, indicating breach of tolerance. The results indicate that a plant-derived human tumour-associated antigen is equivalent to the human antigen in the context of immune recognition.     

K88大肠杆菌菌毛蛋白发酵工艺条件优化研究

分别采用LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、强化营养培养基、玉米浆培养基对大肠杆菌K88进行发酵培养,选出最适于大肠杆菌K88生长的玉米浆培养基;采用正交实验对玉米浆培养基的C／N、K2HPO4／KH2PO4、Mg^2＋的配比进行优化,筛选最适于大肠杆菌K88生长的营养配比;研究生长曲线、接种量以及菌体和菌毛生产量的相关性,根据实验结果优化发酵培养条件,确定菌种的最佳发酵工艺,以收获最多的K88菌毛蛋白。研究表明,K88大肠杆菌在玉米浆培养基C／N、K2HP04／KH2PO4的配比分别为5／11、1／1,Mg^2＋为0．1g/mL,pH值为7．2,转速为200r／min,接种量为4．5％的条件下发酵26个小时,菌体和菌毛生产量均达到高峰,同时得出菌毛蛋白产生量和菌体量成正相关。     

大肠杆菌耐热性肠毒素STI三重串联突变体与黏附素K99融合基因的表达研究

产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是一种导致仔畜和婴儿腹泻的主要病原之一,它的毒力因子主要有两类：黏附素（CFAs）和耐热性肠毒素（ST）或不耐热性肠毒素（LT）。通过PCR技术及双酶切连接技术,成功构建了含有3个STI突变体和1个黏附素K99基因的重组表达质粒pE3S(S)LK和pE3S(G)LK。重组菌株BL21(DE3) (pE3S(S)LK)和BL21(DE3)(pE3S(G)LK)的表达产物经SDS-PAGE和免疫印迹分析,表明以上两种重组菌株均能高效表达3STI(S)-K99和3STI(G)-K99融合蛋白,且融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922 抗血清特异性识别。其次,利用乳鼠灌胃实验检测重组蛋白的生物学毒性,结果均为阴性(G/C值≤0.083),这表明该菌株已无STI生物学毒性。这些为研发预防大肠杆菌性腹泻的新型高效多价基因工程疫苗提供了基本素材和理论指导。     

抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶融合蛋白表达载体的构建

目的是构建抗菌肽B(Cecropin B)和人溶菌酶(hLyso)的融合蛋白表达载体。从pUC118～hLyso上卸下人溶菌酶基因后,通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽B基因,并将其融合到人溶菌酶基因的5’端。将抗菌肽B基因和人溶菌酶基因按正确的阅读框架定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a,终止子位于人溶菌酶基因的3’端。PCR鉴定及序列分析表明,所转化的BL21(DE3)菌落中含有插入Cecropin B-hLyso基因的重组质粒pET32a-CB-hLyso。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因表达系统构建

从E .coli 4 4 815株基因组DNA中扩增不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因并分析了核苷酸序列 ,构建pET32a的LTB表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用SDS PAGE鉴定表达产物。克隆的LTB基因与报道的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 97.5 8%～ 99.19% ,pET32a LTB BL2 1DE3系统表达的rLTB量约占细菌总蛋白的 30 %。     

A组轮状病毒VP6与霍乱毒素B亚基融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物活性分析

利用霍乱毒素B亚基 (CholeratoxinBsubunit,CTB)的免疫载体作用 ,将轮状病毒相关抗原引入口服免疫体系 ,可激起有效的粘膜免疫反应 ,这里报道了CTB基因与A组轮状病毒地方株T114VP6全基因的融合 ,并在大肠杆菌BL21(DE3 )中进行了融合蛋白的表达。在IPTG诱导下得到分子量为 5 6kD的融合蛋白 ,表达量占菌体蛋白的15 %。分别用抗CT的抗体和抗A组轮状病毒的高价免疫血清进行WesternBlot检测 ,结果证明融合蛋白CTB VP6保留了天然霍乱毒素B亚基及轮状病毒VP6的抗原性。G_M1-ELISA检测表明 ,复性后的融合蛋白具有与神经节苷脂GM1 结合的能力。     

淋球菌porB和大肠杆菌ltB融合基因的构建、表达及其免疫活性

【目的】构建融合基因原核表达载体pET-30a/ltB-porB,并表达重组融合蛋白LTB-PorB,鼻饲途径免疫雌性BALB/c小鼠,分析重组融合蛋白的免疫活性,为研制抗淋病蛋白疫苗提供实验依据。【方法】构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与淋球菌外膜孔蛋白B(PorB)融合基因及LTB、PorB单基因pET-30a原核表达载体,在大肠杆菌BL21中表达重组蛋白;鼻饲途径免疫雌性BALB/c小鼠,检测体液免疫和细胞免疫水平。【结果】在大肠杆菌BL21中获得高效表达的重组蛋白;经鼻饲免疫小鼠后,重组融合蛋白LTB-PorB组生殖道黏膜产生的PorB特异性sIgA水平随免疫时间呈上升趋势,第42天A450值达0.66,明显高于对照组(P0.01),效价高达1∶1280;血清中产生的PorB特异性IgG第28天达最高,A450值为0.60,明显高于LTB和蛋白溶解液(Solution Buffer)对照组(P0.01),效价高达1:2560,但与PorB对照组血清IgG水平(A450:0.57)无明显差异(P0.05)。LTB-PorB组脾淋巴细胞刺激指数明显高于LTB和SolutionBuffer对照组(P0.05),但脾淋巴细胞诱生的IFN-γ水平与对照组无明显差异(P0.05)。【结论】重组融合蛋白LTB-PorB通过鼻饲途径免疫雌性BALB/c小鼠后,能诱导产生高水平的体液免疫和一定水平的细胞免疫。首次证实黏膜佐剂LTB可辅佐PorB诱导小鼠产生高水平的生殖道粘膜免疫。