青稞HvnRPS2基因克隆及其在条纹病胁迫下的表达分析

为探索NBS LRR类基因RPS2在青稞抗条纹病过程中的作用,该研究以抗条纹病青稞品种‘昆仑14号’和感病品种‘Z1141’为材料,参照转录组序列设计引物,克隆得到一个差异表达的青稞HvnRPS2基因,进行相应的生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(qRT PCR)法分析HvnRPS2基因在条纹病侵染下不同抗性青稞品种的表达模式。结果表明：(1)HvnRPS2基因全长3 089 bp,无内含子,包含1个2 760 bp的开放阅读框,编码919个氨基酸,理论等电点为5.93,预测蛋白分子量为104.2 kD,其编码的蛋白为亲水性蛋白,二级结构主要由无规则卷曲和ɑ 螺旋组成。(2)蛋白质多序列比对及进化树分析表明,HvnRPS2含有高度保守的NB ARC和LRR结构域,属于NB ARC蛋白家族成员,与大麦HvRPS2和水稻OsRPS2亲缘关系最近。(3)qRT PCR分析显示,随着条纹病感病时间的延长,青稞HvnRPS2基因表达量呈先降低后升高再降低的模式;与正常叶片相比,感病叶片的HvnRPS2基因表达量显著下调,且感病品种表达量下调值显著低于抗病品种(P＜0.01)。研究认为,HvnRPS2在青稞抗条纹病过程中发挥重要的负调控作用。研究结果为进一步探究该基因在青稞抗条纹病中的调控机理奠定基础。     

青稞HvtAGO1基因的克隆及其在条纹病胁迫下的表达

AGO蛋白是RNA诱导沉默复合体的核心分子,在植物的生长、发育及胁迫响应中起重要作用.为探索青稞AGO基因在青稞抗条纹病病原菌过程中的作用机制,该研究以抗条纹病青稞品种‘昆仑14号’和感病品种‘Z1141’为材料,利用条纹病原菌侵染两品种,从感病前后的转录组测序结果中获得一个差异表达基因,克隆验证了该基因为HvtAGO...     

黑粒青稞HvtUF3GT基因的克隆与表达分析

该研究以黑粒青稞品种‘黑老鸦’籽粒为材料,克隆了青稞类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因(HvtUF3GT),获得1 449 bp序列。HvtUF3GT基因包含一个1 434 bp开放阅读框,编码478个氨基酸,理论等电点为5.45,预测蛋白分子量为52 912.58 Da。蛋白质序列分析表明,HvtUF3GT为亲水性的不稳定酸性蛋白,且在C-末端具有一段典型的44个氨基酸PSPG box,在空间结构中含有β-α-β-α-βRossmann折叠结构,属于UDP糖基转移酶基因GT-B型超家族成员。进化树分析表明,HvtUF3GT与小麦族的大麦、乌拉尔图小麦、山羊草和二穗短柄草的糖基转移酶聚为一个分支,且与大麦的亲缘关系最近,与稻族的籼稻和短花稻的亲缘关系较远。半定量和定量PCR结果表明,在‘INB0N-7’蓝粒青稞和‘昆仑12号’白粒青稞的籽粒灌浆后期HvtUF3GT基因不表达,而在黑粒青稞和紫粒青稞中的表达强弱依次为‘黑老鸦’(黑粒)‘昆仑17号’(黑粒)‘达章紫’(紫粒)‘涅如姆扎’(紫粒)。研究推测,HvtUF3GT基因在青稞灌浆后期籽粒着色过程中发挥着重要作用。     

黄毛草莓FnMYB24转录因子基因和启动子的克隆及表达分析

该研究以黄毛草莓(Fragaria nilgerrensis Schltdl.)为材料,采用RT PCR技术克隆了黄毛草莓FnMYB24基因的cDNA和启动子序列。生物信息学分析表明,FnMYB24的cDNA序列长为1 033 bp(GenBank登录号为MN879283),其开放阅读框(ORF)长为609 bp,编码202个氨基酸,含有1个保守的MYB_DNA binding结构域。同源分析结果显示,黄毛草莓FnMYB24基因编码的氨基酸序列与森林草莓(Fragaria vesca)编码的氨基酸相似性较高;同时进一步克隆了该基因编码起始位点上游长度为718 bp启动子序列(GenBank登录号为MN879285),预测该序列包含激素响应元件、光调控元件等多个顺式作用元件。通过构建pFnMYB24∷GUS表达载体进行烟草瞬时转化,发现pFnMYB24启动子具有转录活性且能够驱动FnMYB24基因表达。实时荧光定量PCR结果显示：抗病品种黄毛草莓和易感病栽培品种‘妙香3号’的叶片接种胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)后MYB24基因表达量均有上调,但‘妙香3号’的MYB24表达量始终低于黄毛草莓的表达量;SA处理后2个草莓品种的MYB24表达量均高于对照组,表明MYB24基因受水杨酸(SA)的诱导表达。研究表明,草莓MYB24基因可能参与调控抗炭疽病,为进一步研究MYB24基因在草莓抗炭疽病中的功能奠定了基础。     

百合LbCAT和LbGPX基因的克隆与表达分析

以切花百合(Lilium brownii var. viridulum)‘卡瓦纳’cDNA为模板,克隆了过氧化氢酶(LbCAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(LbGPX)基因。序列分析表明,这2个基因分别包含1 479 bp和519 bp的开放阅读框(ORF),编码492个和172个氨基酸。进化分析结果表明,LbCAT蛋白与岷江百合CAT蛋白的氨基酸序列相似性最高(99.19%),且亲缘关系最近;LbGPX蛋白与油棕GPX蛋白的氨基酸序列相似性最高(78.61%),亲缘关系最近。qRT PCR结果显示,LbCAT和LbGPX在百合根、鳞茎、叶和花中都有表达。LbCAT在叶中表达量最高,LbGPX在花中表达量最高。这2个基因在百合花蕾的生长发育过程中均有表达,且表达量逐渐增加;在PEG处理后2个基因的转录水平升高,但独角金内酯(SLs)处理却显著降低了这2个基因的转录水平;该结果为百合抗逆性机理研究以及抗逆育种奠定了基础。     

玉米ZmSOD基因克隆及其在干旱胁迫下的表达

为探讨超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)基因在玉米抗逆反应中的作用,研究选用2个抗旱性有明显差别的玉米品种为试验材料,采用RT-PCR、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及二维凝胶电泳(2-DE)耦联的基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF)法,对ZmSOD基因的序列结构及其在干旱胁迫下的表达特性进行分析。结果表明：(1)从干旱敏感品种‘登海605’(DH605)和抗旱品种‘蠡玉35’(LY35)玉米叶片中分别成功克隆出ZmSOD1和ZmSOD2基因。DH605中ZmSOD1开放阅读框(ORF)全长456 bp,编码151个氨基酸,编码的蛋白等电点为5.76,分子量为15.05 kD。LY35中ZmSOD2ORF全长459 bp,编码152个氨基酸,编码的蛋白等电点为5.65,分子量为15.11 kD;ZmSOD1和ZmSOD2是亲水性稳定蛋白,都含有Cu/Zn-SOD结构域,蛋白序列N端无信号肽及无跨膜结构域。同源性和系统进化分析表明,玉米ZmSOD和谷子Cu/Zn-SOD2的亲缘关系最近,相似性高达96.05%。(2)在干旱条件下,ZmSOD1在DH605中转录水平明显降低,LY35中ZmSOD2转录水平显著升高;2-DE耦联的质谱分析显示：ZmSOD1在DH605中表达量明显降低,LY35中ZmSOD2表达量无显著性变化,却检测到Mn-SOD蛋白表达量显著增加。(3)相关分析显示,干旱条件下,DH605叶片中ZmSOD1转录水平和其蛋白丰度及SOD酶活性呈极显著性正相关,LY35叶片中ZmSOD2转录水平与SOD酶活性呈显著性正相关。研究结果为进一步探索SOD基因在调节玉米抗性以及逆境胁迫应答过程中的作用机制提供了基础。     

不结球白菜BcMLPK基因在自交不亲和中的功能研究

该研究以不结球白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino)自交不亲和系品种‘矮脚黄’为实验材料,利用VIGS技术将BcMLPK基因构建到pTY载体,进行定量分析,研究其在自交不亲和中的功能。结果表明：(1) BcMLPK基因序列长为1 443 bp,编码480个氨基酸,将BcMLPK蛋白氨基酸序列与其他物种的MLPK氨基酸比较表明,BcMLPK基因与其他物种中该基因具有高度保守的结构域。(2) 成功构建pTY BcMLPK载体,采用基因枪法侵染‘矮脚黄’,其新生的真叶有明显的花叶症状,选取发病的叶片及花蕾进行实时定量qRT PCR,发现侵染的植株中BcMLPK基因表达量约为对照组的50%。(3) 花期对植株进行自交授粉,实验组有明显的结荚现象,而对照组则出现雌蕊未能明显伸长,显示受精异常的现象;统计结果表明实验组的自交不亲和指数和结实率均高于对照组。研究表明,不结球白菜MLPK基因的沉默能够抑制‘矮脚黄’自交不亲和相关基因BcMLPK的转录水平表达。     

不结球白菜金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

通过RACE技术,从不结球白菜抗病品种‘苏州青’叶片克隆到金属硫蛋白(metallothionein)基因的全长cDNA序列(BcMT2)。序列分析结果表明,BcMT2基因的cDNA全长为528 bp,其中开放阅读框长度为243 bp,共编码80个氨基酸,相对分子质量为8.02×10³ Da,理论等电点是4.61。氨基酸同源系统进化分析表明,不结球白菜BcMT2基因属于Ⅱ类植物MT2基因家族,且与同科植物的进化关系相近,其中与大白菜第5号染色体的基因(Bra029765)相似性最高(100%)。qRT PCR分析表明,BcMT2基因在不结球白菜叶中表达最强;霜霉病菌诱导后,BcMT2基因在抗病品种‘苏州青’中的表达量于48 h达到峰值,而在感病品种‘矮脚黄’中的表达量于72 h达到峰值;盐处理条件下,BcMT2基因在抗病品种‘苏州青’中的表达量于12 h达到峰值,而在感病品种‘矮脚黄’中的表达量于24 h达到峰值;ABA处理下,‘苏州青’中其表达量于24 h达到峰值,且在‘矮脚黄’中BcMT2基因的表达趋势与‘苏州青’类似;干旱处理条件下BcMT2基因的表达在两材料中均受到抑制。BcMT2原核表达分析发现,在37 ℃、1.0 mmol·L^-1IPTG诱导2、4 、6 h后,均检测到了一条蛋白分子质量约为8×10³ Da的表达特异条带,这与预期融合蛋白的相对分子质量的理论值8.02×10³ Da相符。研究表明,不结球白菜BcMT2基因在受到生物胁迫和非生物胁迫等逆境条件下均发挥着重要作用,且BcMT2在大肠杆菌中成功实现融合表达,为进一步进行蛋白水平和转基因功能研究奠定了基础,也为选育高产、优质的不结球白菜新品种提供重要的理论依据。     

‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨HHT基因克隆与表达分析

该试验以砂梨品种‘黄花’梨（果皮褐色）及其芽变‘绿黄花’梨（果皮绿色）盛花后第8周的果皮为试材,利用常规PCR和巢式PCR技术克隆了ω 羟基棕榈酸O 阿魏酰转移酶（ω hydroxypalmitate O feruloyl transferase, HHT）基因cDNA的全长,命名为 PpyHHT（登录号为KX131155）。序列分析结果表明,该基因开放阅读框（ORF）为1 335 bp,编码444个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的PpyHHT蛋白质相对分子质量为49.91 kD,等电点是4.75,与白梨相似性高达98%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT PCR）表达分析显示,2种梨果皮中 PpyHHT基因在盛花后6~9周的4个转色关键期表达量不断变化,在‘黄花’梨果皮中的表达量明显高于‘绿黄花’梨。推测 PpyHHT基因可能参与砂梨果实褐色/绿色性状的形成。     

牛支原体LRR5蛋白原核表达及其在牛支原体入侵宿主细胞过程中的作用分析

致病性支原体具有入侵宿主细胞的能力,这是其发挥致病作用的关键。介导支原体入侵宿主细胞的自身功能蛋白可能是一种潜在的药物或疫苗靶标。【目的】克隆表达牛支原体(Mycoplasmabovis) MBOVPG45_0564基因编码蛋白(命名为LRR5蛋白),并探究其在M. bovis入侵宿主细胞过程中的作用。【方法】利用NCBI数据库对MBOVPG45_0564基因进行同源性分析,用Discovery Studio Client系统对LRR5蛋白进行蛋白结构预测;原核表达LRR5蛋白并制备其小鼠多克隆抗体,利用免疫电镜对LRR5蛋白进行亚细胞定位;通过平板计数、激光共聚焦显微镜观察LRR5抗体封闭后M. bovis对胎牛肺(embryonic bovine lung, EBL)细胞入侵率的变化;将LRR5蛋白偶联至荧光微球表面后,以激光共聚焦显微镜及高内涵活细胞成像系统观察微球进入EBL细胞情况。【结果】MBOVPG45_0564基因在牛支原体属中为保守基因,其编码蛋白LRR5为膜相关蛋白,空间构象呈典型的月牙状,多个重复的亮氨酸基序以超螺旋方式组装并形成螺线管蛋白质结构单元。LRR5抗体封闭后,M. bovis对EBL细胞的入侵率显著降低(P<0.05),荧光微球偶联LRR5蛋白后,荧光微球可成功进入EBL细胞。【结论】MBOVPG45_0564基因编码的LRR5蛋白定位在M. bovis膜上,在M. bovis入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。