苦荞种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及部分性质研究

采用凝胶层析及离子交换层析等方法,从苦荞种子中分离出一组胰蛋白酶抑制剂（ＴＢＴＩ－Ⅰ、Ⅱ）．对其性质研究表明：两个组分均对胰蛋白酶有较强的抑制作用,对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱,其中ＴＢＴＩ－Ⅱ的抑制作用大于ＴＢＴＩ－Ⅰ,两者对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制作用．用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶层析分别对纯化产物进行分析得出ＴＢＴＩ－Ⅰ和ＴＢＴＩ－Ⅱ的近似分子量分别为１５．０ｋＤ和１８．０ｋＤ．ＴＢＴＩ－Ⅰ、Ⅱ都具有较高的热稳定性,在１００℃处理１０ｍｉｎ后可保留８６％左右的抑制活性．ＴＢＴＩ在酸性环境下较为稳定,在ｐＨ２．０条件下保温１ｈ,仍保留７５％的抑制活性．用Ｌｉｎｅｖｅａｅｒ－Ｂｕｒｋ作图法得知,该抑制剂属竞争性抑制类型,ＴＢＴＩ－Ⅱ的Ｋｉ值为３．５９×１０－７ｍｏｌ／Ｌ（以ＢＡＰＮＡ为底物）,对胰蛋白酶的摩尔抑制比为１∶１．４．     

菠菜种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与部分性质研究

以菠菜种子为材料,经脱脂、酸性溶液抽提、热变性、硫酸铵分部沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物。再经离子交换、亲和层析和凝胶过滤,分离得到胰蛋白酶抑制剂SOTI,纯化倍数为57．22。SDS-PAGE测定其分子量约为22kD,等电聚焦测定其等电点为4．02。SOTI具有较高的热稳定性,在100℃处理后仍然具有一定的抑制活性。     

海芋胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究

利用亲和层析和分子筛凝胶过滤等技术,从海芋根茎中分离纯化到一种胰蛋白酶抑制剂,简称ＡＭＴＩ。经ＰＡＧＥ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定均显示单一条带,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定,其分子量为２２０００,经等电聚焦（ＩＥＦ）测定,其等电点为６．２。根据对胰蛋白酶的抑制比可知该抑制剂为单头抑制剂,其抑制活性在６０℃和ｐＨ５￣１１范围内保持稳定。     

苦豆子多糖的分离纯化及初步结构

本文研究了苦豆子多糖的分离纯化以及初步结构。采用水溶醇沉方法提取粗多糖,然后通过离子交换层析分离纯化,采用高效凝胶渗透色谱、气相色谱、紫外吸收以及红外吸收光谱对多糖组分进行分析研究。获得苦豆子多糖相对分子质量均一性组分SPN和SPA,测得其平均相对分子质量分别为1.217×106Da和4.412×105Da,二者均不含蛋白质,且都具有红外的多糖特征吸收峰,其单糖组成(质量比)分别为阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=7.90∶11.24∶86.24∶18.81∶16.89、鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.50∶5.80∶1.72∶20.10∶1.64∶27.20。本文为苦豆子多糖的进一步研究开发提供理论依据。     

波叶青牛胆胰蛋白酶抑制剂的纯化及其性质研究

采用亲和层析及电泳制备等方法 ,从防已科植物波叶青牛胆 (Tinosporacrispa)根茎中分离到一种胰蛋白酶抑制剂TCTI。对其性质研究表明 :TCTI的相对分子量约为 10 0kD ,对牛胰蛋白酶的抑制常数Ki为 2 0 8× 10 7mol/L (BAPNA为底物时 ) ,摩尔抑制比为 1∶3 5 ,是一种抑制活力很强的竞争性抑制剂。TCTI具有很高的耐热性 ,在 10 0℃加热 60min ,仍保持 93%的抑制活力。另外 ,TCTI在低温容易结晶     

鹰嘴豆种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与鉴定

为了寻找具有药物作用的天然胰蛋白酶抑制物,采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析(DEAE-纤维素52)及Sephadex G-100凝胶层析等方法, 从鹰嘴豆种子中分离出一种鹰嘴豆胰蛋白酶抑制剂（CPTI）. 研究表明：CPTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制率达80%,而对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱,抑制率为32%, 对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制作用; 用SDS-PAGE测得CPTI近似分子质量为25.7 kD; CPTI具有较高的热稳定性,在100 ℃下加热60 min,对胰蛋白酶活性仍保持78%抑制率; Lineveaer-Burk作图得知该抑制剂属竞争性抑制类型. 动力学测定显示,来自鹰嘴豆中的CPTI对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为3.99×10^-7 mol/L.     

苦豆子多糖的分离纯化及初步结构北大核心CSCD

本文研究了苦豆子多糖的分离纯化以及初步结构。采用水溶醇沉方法提取粗多糖,然后通过离子交换层析分离纯化,采用高效凝胶渗透色谱、气相色谱、紫外吸收以及红外吸收光谱对多糖组分进行分析研究。获得苦豆子多糖相对分子质量均一性组分SPN和SPA,测得其平均相对分子质量分别为1.217×106Da和4.412×105Da,二者均不含蛋白质,且都具有红外的多糖特征吸收峰,其单糖组成(质量比)分别为阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=7.90∶11.24∶86.24∶18.81∶16.89、鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.50∶5.80∶1.72∶20.10∶1.64∶27.20。本文为苦豆子多糖的进一步研究开发提供理论依据。     

半夏胰蛋白酶抑制剂的纯化与部分性质研究

应用以胰蛋白酶为配体的亲和层析法,从生半夏蛋白粗提液的40％（NH。）：SO4（M／V）沉淀中分离纯化出一种胰蛋白酶抑制剂（Rhizoma pinelliae trypsin inhibitor,RVn）,经SDS．PAGE检测呈现单一条带,分子量为14kD左右,其N-端6个氨基酸残基顺序为DPVVDG。研究表明,其对胰蛋白酶的质量抑制比为l：4．72左右,对人低分化胃腺癌细胞系（BGC-823）的细胞增殖具有抑制作用,IC50值为121．53μg／mL。     

苦豆子生物碱的研究与苦豆子综合利用

本文综述槐属植物苦豆子的生物学特性,自然资源,综合利用及其生物碱的研究。     

苦荞胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性研究

利用固相胰蛋白酶亲和色谱及离子交换色谱,从苦荞种子中分离纯化了三个具有抑制胰蛋白酶活力的组份(BTI-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)。经聚丙稀酰胺凝胶等电聚焦测定,三种抑制剂的等电点为6.87,6.7,5.14。根据Sephadex G-75凝胶过滤,SDS-PAGE测定,以及由当量抑制比值和氨基酸组份的推算,它们的分子量范围分别为5200-5700(Ⅰ),5500—6000(Ⅱ),5000—5600(III)。三者对胰蛋白酶的抑制常数分别为2.12×10~(-8),4.78×10~(-9),1.22×10~(-8)。氨基酸分析结果表明,它们均含有很高的极性氨基酸。在酸性条件下,它们均具有很高的热稳定性。化学修饰的结果表明,它们活性中心的氨基酸残基为Lys。     

黑豆种子中一种耐热型胰蛋白酶抑制剂的分离及性质表征

应用硫酸铵分级沉降、弱阳交换色谱CM-Sephadex C-50、凝胶过滤 色谱Sephacryl S-200HR、强阳离子高效液相色谱POROS HS-20,从黑豆种 子中分离纯化一种耐热型蛋白酶抑制剂,命名为TSTI.该蛋白的Ｎ末端序列 为DEYSKPCCDLCMCTRRCPPQ,与豆科植物Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂具有 高度同源性,推测其属于Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂.SDS－PAGE和IEF 测出TSTI分子量和等电点分别为23.9 kD 和6.2.TSTI对胰蛋白酶有很强的 抑制作用,当二者摩尔比达到1时,胰蛋白酶活力被完全抑制.此外,该蛋 白酶抑制剂具有很强的热稳定性和pH稳定性,在高达100 ℃温度及pH2-12 范围内处理,其活性均不会受到太大影响.TSTI对植物致病菌苹果轮纹病菌 、瓜果腐霉病菌、白菜黑斑病菌、甜瓜枯萎病菌和葡萄灰霉病菌具有抑制 作用.     

荞麦胰蛋白酶抑制剂的原核表达及纯化

根据文献报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及本研究室先前已获得的部分基因序列设计引物,经过RT-PCR扩增,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂编码区基因全序列.将该基因克隆到原核表达载体pQE-31中,并转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达获得可溶性目的蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的25%.该目的蛋白经Ni2 -NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE分析显示,在大约9kD处出现明显的目的条带,与预计蛋白分子量大小一致.Western blot鉴定证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.活性测定表明,目的蛋白具有专一性的胰蛋白酶抑制剂活性,抑制活性约为77U/mg纯化蛋白.本实验为进一步研究荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系奠定了基础.     

山东产野生大豆胰蛋白酶抑制剂的初步研究

该实验建立了HPLC测定大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)活性的方法,并对山东产野生大豆(G.soja)与同地区产的黑豆和黄豆(G.max)的胰蛋白酶抑制活性差异进行了比较.用耦合了胰蛋白酶的亲合色谱柱对野生大豆的STI进行分离纯化,紫外分光光度法比较3种大豆的STI含量;PCR结合TA克隆技术对野生大豆STI中的Kunitz型(KSTI)蛋白基因编码区的氨基酸顺序进行初步测定.结果发现,山东产野生大豆的STI活性和含量均高于同地区产的黑豆和黄豆;山东产野生大豆的KSTI蛋白基因编码区的氨基酸顺序与已知的Tia型基本一致,仅第59位氨基酸由于单核苷酸的置换发生了Ser→Thr的转变,此位置位于活性中心附近.研究表明,山东产野生大豆胰蛋白酶抑制活性较强,且含量高.     

苦豆子的组织培养及植株再生的研究

用4种诱导培养基P1(MS+2,4-D0.5mg/L)、P2(MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L)、P3(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L)、P4(MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L),3种分化培养基(MS+6-BA1mg/L;MS+6-BA0.5mg/L;MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L)和4种生根培养基(MS;MS+IBA1mg/L;MS+IBA1mg/L+IAA0.5mg/L;1/2MS+IAA0.2mg/L)对苦豆子愈伤组织进行诱导和植株再生,研究影响苦豆子组织培养的因素,结果表明愈伤组织的诱导频率主要依靠激素的种类和浓度,培养基中加入0.2～2mg/L的2,4-D有利于苦豆子愈伤组织生长,但使褐化发生时间提前;培养基中加入活性炭对苦豆子愈伤组织褐化有明显的抑制作用;加入IAA对苦豆子根的分化是必需的。     

两种苦豆子染色体的初步观察

苦豆子和准噶尔苦豆子均属豆科,槐属,弯果系,为野生灌木。可作绿肥,能固沙,根可作药用,是治疗痢疾、咳嗽等疾病的植物药新资源,在我国西北各省区均有大量分布。     

苦豆子游离氨基酸的成份测定

本文分析和鉴定了苦豆子中游离氨基酸的成份,测定出１６种游离氨基酸,总量为１６４．５２μｇ／１００ｍｇ,其中谷氨酸含量最高为４７．６８μｇ／１００ｍｇ,蛋氨酸含量最低为０．２０μｇ／１００ｍｇ,人体必须氨基酸有７种,占游离氨基酸总量的１７．３３％。     

非洲爪蟾血清白蛋白的分离纯化及胰蛋白酶抑制活性

通过凝胶过滤层析及两步阴离子交换层析,从非洲爪蟾(Xenopus laevis)的血清中获得了其68kDa的血清白蛋白。与大蹼铃蟾血清白蛋白相似,非洲爪蟾血清白蛋白也具有抑制胰蛋白酶的活性,但其抑制活力相对较低,180nmol/L的非洲爪蟾血清白蛋白能抑制84%的胰蛋白酶活性(30nmol/L)。经表面等离子共振法获得了其与胰蛋白酶的结合动力学常数,解离平衡常数KD=1.44×10-6mol/L。经Western blot分析发现,非洲爪蟾的皮肤中也分布有血清白蛋白。推测两栖类动物血清白蛋白具有的胰蛋白酶抑制活性可能是其抵御天敌捕食的一种防御措施。