鸭梨多酚氧化酶基因反义表达载体的构建及农杆菌介导的遗传转化

根据鸭梨多酚氧化酶基因序列设计引物,PCR扩增该基因3′端450bp的片段,并将该片段反向插入真核表达载体pB I121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,首次构建了鸭梨PPO基因的反义表达载体;其后,在农杆菌EHA105的介导下,成功实现了PPO反义基因对鸭梨组培苗的遗传转化。经Northern杂交和酶活检测证实,转基因鸭梨植株体内的多酚氧化酶基因转录和翻译水平均得到明显抑制,从而为耐褐化梨新品种的培育奠定了基础。     

葡萄组织培养苗不同节位茎段的生长、生根以及多酚氧化酶和IAA氧化酶的活性

本文探讨葡萄不同节位茎段对组织培养苗生长和生根以及多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)和IAA氧化酶活性的影响。欧洲葡萄品种无核白(Vitis vinifera cv.Thompson seedless)试管苗,     

苹果多酚氧化酶双链RNA干扰(RNAi)研究

以成熟苹果果实的RNA为模板,经RT-PCR扩增并克隆苹果多酚氧化酶(APPO)长度为710bp的反义、正义基因片段.以副球菌中类胡罗卜素合成有关的(crtW+crtY)融合基因片段YYT为间隔区,将APPO反义基因片段、YYT和APPO正义基因片段串联,构成全长为2446bp的DNA并插入到植物双元载体pYPX145中,构成可表达苹果多酚氧化酶双链RNA的植物双元载体pYF7704.以根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化苹果栽培品种红富士,通过50mg/L卡那霉素筛选和GUS检测,获得了转基因苹果抗性芽.荧光定量RT-PCR检测结果显示,转基因苹果抗性芽内多酚氧化酶基因的干扰效果达91.69%以上,研究结果证实多酚氧化酶双链RNA干扰在转基因苹果上是可行的.     

砀山酥梨石细胞发育过程中PPO酶学特性及其cDNA片段克隆

以砀山酥梨果实为材料,研究了影响石细胞形成的木质素合成酶-多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的酶学特性,并对PPO基因进行了克隆.结果表明,在砀山酥梨果实发育的过程中,PPO活性在花后27 d和47 d出现高峰,早于木质素含量高峰(花后47 d、61 d)和石细胞团含量高峰(花后51 d),且P...     

苹果多酚氧化酶双链RNA干扰（RNAi）研究

以成熟苹果果实的RNA为模板,经RT—PCR扩增并克隆苹果多酚氧化酶(APPO)长度为710bp的反义、正义基因片段。以副球菌中类胡罗卜素合成有关的(crtW crtY)融合基因片段YYT为间隔区。将APPO反义基因片段、YYT和APPO正义基因片段串联,构成全长为2446bp的DNA并插入到植物双元载体pYPX145中,构成可表达苹果多酚氧化酶双链RNA的植物双元载体pYF7704。以根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化苹果栽培品种红富士,通过50mg／L卡那霉素筛选和GUS检测,获得了转基因苹果抗性芽。荧光定量RT—PCR检测结果显示,转基因苹果抗性芽内多酚氧化酶基因的干扰效果达91．69％以上,研究结果证实多酚氧化酶双链RNA干扰在转基因苹果上是可行的。     

鸭梨PPO与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察

将鸭梨PPO基因与绿色萤光蛋白GFP基因相融合共同进行遗传转化的方式,对鸭梨多酚氧化酶开展细胞定位研究。通过克隆该酶基因除终止密码子TAA外长度为1 779bp的CDS序列,与绿色荧光蛋白基因重组构建了荧光表达载体pBI121-PPO-GFP,借助农杆菌转化烟草,转基因烟草叶片细胞经激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光与叶绿体自发荧光相重合。结果表明鸭梨多酚氧化酶为叶绿体蛋白质。     

植物多酚氧化酶的研究进展

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一类普遍存在于植物、真菌和昆虫质体中,由核基因编码,能与铜相结合的金属蛋白酶.它能分别催化单酚羟基和二羟基酚氧化为O-二酚和O-醌.植物多酚氧化酶是许多果蔬等农产品酶促褐变的主要原因,同时它在植物的光合作用、抗病虫害、生长发育以及花色的形成中起一定作用.本文综述了植物多酚氧化酶在细胞学、分子遗传学及其生产应用等方面的研究进展.     

砀山酥梨多酚氧化酶基因(PbPPO)的原核表达及优化研究

从砀山酥梨Pyrus bretschneideri ‘Dangshan Su’果实中克隆得到一条多酚氧化酶基因(PbPPO)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JF809859)。通过生物信息学分析表明,PbPPO基因CDS区全长1782 bp,编码593个氨基酸,氨基酸序列由N端叶绿体转运肽、Cu结合区与C端疏水区三部分组成。为进一步研究Pb PPO基因的功能,成功构建其原核表达载体pET-28a-PbPPO,并在大肠杆菌Rosetta菌株中成功诱导表达,经优化后显示,在28℃、1.0 mmol·L~(-1) IPTG诱导5 h的条件下,融合蛋白表达量最高。     

丹参多酚氧化酶基因的克隆及表达分析

前期研究发现多酚氧化酶(PPO)能正向调控丹酚酸B合成,该研究运用RACE技术,从丹参毛状根中克隆到多酚氧化酶基因(SmPPO,GenBank登录号为KF712274)全长序列,其cDNA全长1 930bp,开放阅读框为1 770bp,编码589个氨基酸。将SmPPO与管状花目其它4个物种进行氨基酸序列比对,在N端类囊体转移结构域中发现都存在2个N-豆蔻酰化位点。在丹参毛状根培养液中加入不同诱导因子,利用实时荧光定量PCR检测,发现该基因在酵母提取物处理中表达量显著上调,但在银离子、抗坏血酸和L-半胱氨酸处理中表达受到明显抑制。运用HPLC技术同步检测毛状根中丹酚酸B含量,显示出与基因表达相同的变化趋势。研究表明,丹参中多酚氧化酶基因(SmPPO)对丹酚酸B的合成具有正向调控作用。     

花同源异型基因FBP2调节叶片中过氧化物酶的表达

对碧冬茄和烟草的野生型以及FBP2转化植株(transformant)叶片中过氧化物酶 (POD)的特性做了分析 ,结果表明FBP2在花中的表达可以调节叶片特异POD的表达 ,并影响其活性。此外 ,FBP2在花中的表达还影响叶片内源植物生长物质的水平以及多酚氧化酶 (PPO)和过氧化氢酶 (CAT)的活性。结果表明 :花同源异型基因不仅调控花器官的发育 ,而且参与营养器官代谢的调节 ,使之适应于生殖器官的生长发育     

龙眼DlPPO1基因的克隆及其表达调控分析

该研究根据同源克隆技术,利用RT-PCR和RACE技术,以‘四季蜜’龙眼叶片cDNA为模板,获得龙眼多酚氧化酶基因(polyphenol oxidase,PPO)的3个转录本DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c的cDNA全长序列(KM387405、KM516087和KM516088)和1条DNA序列DlPPO1(KU837229)。DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c的全长分别为1 969、1 960和1 920bp,包含相同的完整开放阅读框1 800bp并编码599个氨基酸;该基因与荔枝、橄榄和枣等物种的PPO基因同源性较高。生物信息学分析表明,DlPPO1保守结构域具有多酚氧化酶的典型结构域特征。利用实时荧光定量PCR技术检测DlPPO1表达结果表明,在龙眼体胚发生过程中,DlPPO1从心形胚时期开始上调表达至子叶胚时期达到最高,推测其在龙眼体胚发生中后期可能发挥重要作用;DlPPO1在龙眼叶片中表达量最高,其次是花芽,而在其他组织部位表达量较低。激素和非生物胁迫处理下的表达分析表明,水杨酸(SA)、低浓度茉莉酸甲酯(MeJA)、NaCl、甘露醇及PEG可诱导DlPPO1基因上调表达,这些表达模式暗示其可能参与多种非生物胁迫应答过程。     

植物多酚氧化酶的研究进展

多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是一类普遍存在于植物、真菌和昆虫质体中,由核基因编码, 能与铜相结合的金属蛋白酶。它能分别催化单酚羟基和二羟基酚氧化为O-二酚和O-醌。植物多酚氧化酶是许多果蔬等农产品酶促褐变的主要原因, 同时它在植物的光合作用、抗病虫害、生长发育以及花色的形成中起一定作用。本文综述了植物多酚氧化酶在细胞学、分子遗传学及其生产应用等方面的研究进展。     

烟草中多酚氧化酶(PPO)的特征

烟草中的多酚氧化酶介导的褐变会影响烟叶和烟丝的色泽和内在质量,因此对其特性的研究,以及活性的控制成为多年来的研究热点。本文从其生物发生模型、分子结构、生物化学和光谱学特征与植物抗病和机械损伤的关系,多酚氧化酶的抑制、多酚氧化酶的应用等方面着手,对近几年来烟草中PPO研究的最新成果进行总结和回顾,对一些有争议的问题进行了探讨,并对未来PPO研究的方向和领域进行了展望。     

丛枝菌根真菌对烟草香气相关物质代谢的影响

丛枝菌根(AM)真菌能够与植物共生,促进寄主植株营养元素的吸收,提高植株抗逆性,但鲜见其对香气物质代谢作用的报道。本试验研究了AM真菌摩西球囊霉对烟草叶片腺毛和香气相关物质代谢的影响。结果表明: 接种AM真菌能够增加烟草叶片腺毛的密度,并诱导烟草叶片腺体毛状体脂质分泌所必需的腺体特异性脂质转运蛋白基因(NtLTP1)表达量增加;提高香气相关物质绿原酸、茄尼醇和类胡萝卜素含量;同时促进了香气物质合成途径中关键酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性;诱导香气相关物质代谢关键酶苯丙酰胺转氨酶和多酚氧化酶基因NtPAL和NtPPOE,以及黄酮醇合酶和角鲨烯合酶基因NtFLS和NtTSS表达上调。说明接种摩西球囊霉能够增加香气产生部位腺毛的数量和分泌活性,并促进烟草叶片香气物质的生物合成过程。     

真菌源激发子对采后葡萄果皮抗性产生的诱导

利用细胞壁提取法从葡萄采后致病菌Alternaria alternate(Fr．)Keissl中提取出激发子。在采前一周用激发子处理葡萄,研究激发子诱导葡萄采后抗病效果。结果表明：葡萄经激发子处理后,果皮内与抗病有关的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性显著增强,酚类物质和木质素含量也显著提高,贮藏期自然发病率和发病指数降低,其中以125μg·mL-1处理效果最好,果实发病率和发病指数比对照降低500％左右。     

β-氨基丁酸对拟南芥叶片花色素苷的影响

研究发现β-氨基丁酸（BABA）处理减少了拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片花色素苷的积累,而且BABA处理降低了花色素苷合成基因（CHS,LDOX,UF3GT）的表达,却上调了苯丙氨酸解氨酶（PAL）的表达,同时促进了花色素苷降解酶多酚氧化酶（PPO）的活性。叶片对DPPH（1,1-二苯基-2-苦基苯肼）的清除能力、总酚和类黄酮含量以及电导率和细胞死亡率的测定表明BABA降低了叶片的抗氧化能力、电导率及细胞死亡率。结果表明BABA处理抑制了花色素苷在叶片中的积累。     

马铃薯多酚氧化酶基因克隆及反义表达载体构建

从甘农薯1号马铃薯试管苗叶片中提取总DNA,根据Genebank报道的马铃薯多酚氧化酶基因(PPT32)序列,设计合成了带有BamHⅠ、SacⅠ特定酶切位点的2对特异引物,通过PCR获得l840bP和476bP的扩增产物。测序结果表明,l840bp的扩增产物与Oenebank中发表的序列一致,476bp的扩增产物正是欲扩增的马铃薯多酚氧化酶基因的同源片段。将2个扩增产物反向连接到表达载体PC3中,通过双酶切鉴定后,按直接导入法实现反义基因表达载体质粒向农杆菌EHA105的导人;并经PCR鉴定证明,此质粒已整合到农杆菌Ti上。     

棉铃虫酚氧化酶原基因的克隆、序列分析和组织表达

利用RT-PCR和RACE方法,获得了棉铃虫Helicoverpa armigera酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)基因一个亚型cDNA的完整序列。该序列全长2 405 bp,含有一个2 097 bp的开放阅读框,编码一个由698个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性(76％～80％),同时该序列具有铜离子结合位点等PPO基因所具有的典型特征。组织特异性表达分析表明,该基因在棉铃虫血细胞、体壁和中肠中均有表达。     

棉花GA 20-氧化酶基因转毛白杨的研究

以毛白杨为材料,研究了超量表达赤霉素合成酶基因(GA20-氧化酶基因)对毛白杨根、茎和叶的生长以及组织结构的影响,结果显示,表达GA20-氧化酶基因能显著提高毛白杨茎的生长,但是对根系的生长带来负面影响.同时,超量表达GA20-氧化酶基因促进了毛白杨茎木质部的生长,抑制了韧皮部和皮层的生长.研究结果表明GA20-氧化酶基因在毛白杨遗传改良中具有一定的应用价值.     

加工型马铃薯品种多酚氧化酶活性的变化规律

为探寻加工型马铃薯多酚氧化跨活性的变化规律,本研究对5个加工型马铃薯品种多酚氧化酶(PPO)活性进行了测定。结果表明：植株生长期间,各组织器官PPO活性发生看规律性变化。叶片PP0活性表现出低—高—低的波动,并于现蕾至决茎膨大期达到高峰[31．12(0．01△OD/／min];块茎PP0活性呈现高—低—高—低的趋势;花药PPO活性交化趋势与叶片相同,并在墨花期达到高峰[129．80(0．01△OD／min]。此外,在同一发育阶段,不同组织器官PPO活性也不同,花药＞匍匐茎＞花蕾、花瓣＞叶片和块茎。进一步检剩结果表明,即使是同一块茎不同部位的PPO活性也呈现较大差分,其中决茎外皮PP0活性最高,髓最低。贮藏待播的决茎芽PPO活性明显高于块茎本身。本项结果对今后利用生物工程技术抑制PPO活性,有效改良加工型马铃薯品种县有重要意义。