重组水蛭素相关肽Hi-lys的表达与纯化(英文)

为开发一种新的有临床应用价值的抗血栓药物,根据水蛭素保持抗凝活性的2 0肽片段,设计并构建了水蛭素相关肽(Hi lys)与天冬酰胺酶C端的融合表达系统.为方便目的肽与融合伙伴的分离,增加了富含带电序列的8肽(KRKRKKSR)及酸敏感的天冬氨酰 脯氨酸(Asp Pro)位点,获得了表达质粒pED P8 Hi lys.将其转化E .coliBL 2 1,玉米浆培养基(kanr)培养,乳糖诱导获得融合蛋白(AnsB C P8 Hi lys)的高效表达.通过细菌裂解、包涵体洗涤、尿素溶解、乙醇沉淀、酸水解和DEAE 纤维素5 2柱层析纯化获得目的肽Hi lys ,用凝血酶测定法测得其抗凝活性为5 0ATU mg .     

水蛭素在噬菌体表面的展示

水蛭素是凝血酶强有力的天然抑制剂。通过改造噬菌质粒并构建水蛭素表达载体pCANTAB 5G8Hir,使水蛭素基因通过接头与噬菌体M13的gp3(197～406)基因片段融合。表达产物在gp8信号肽的引导下到达大肠杆菌周质,在辅助噬菌体M13KO7的帮助下组装到丝状噬菌体外壳上。展示在噬菌体表面的水蛭素仍然具有与凝血酶结合并抑制酶活性的作用,说明展示的水蛭素保持了正确的空间构象和生物学活性。水蛭素在噬菌体表面的功成展示为进一步开展其实验定向进化以及结构与功能关系的研究打下基础。     

白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白表达纯化及活性研究

[目的]采用大肠杆菌表达白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白,表达纯化后进行抗细胞黏附活性及抑制凝血酶活性的功能研究.[方法]将编码白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的基因构建到pET28a载体上,转化菌株Rosetta(DE3)并经IPTG诱导表达后分别经镍柱和分子筛进一步纯化,使用实时细胞分析仪和血凝仪分别测定了白细胞抑制因...     

MLP增强生肌素对nAChRγ亚基基因启动子的结合活性

构建表达GAL4 MLP融合蛋白的真核表达质粒pBind MLP .哺乳动物细胞双杂交试验表明 ,MLP与生肌素E12复合物存在细胞内的相互作用 .构建表达GST融合蛋白GST MLP和GST E12的原核表达质粒pGEX 2TK MLP以及pGEX 4T 2 E12 .在E .coliBL2 1中诱导表达GST MLP、GST 生肌素和GST E12 ,并用亲和层析法纯化了这 3种GST融合蛋白 .这 3种GST融合蛋白进行的凝胶阻滞试验表明 ,MLP可以增强生肌素 E12复合物对AChRγ亚基基因启动子的结合活性 .研究初步阐明了MLP增强nAChRγ亚基基因启动子在分化C2C12细胞中的转录活性的分子机制 .     

hVEGF165 和嵌合水蛭肽融合基因的构建、表达和活性检测

根据抗 PTCA 或支架后再狭窄的基因治疗需要多基因治疗的特点,用基因重组技术构建了 hVEGF165 和嵌合水蛭肽 (fused hirudin , FH) 融合基因,并克隆到真核表达载体 pcDNA3.0 中,通过脂质体介导将 pcDNA3.0/hVEGF165 - FH 转染到人内皮细胞株 (ECV304) 中, RT-PCR 及蛋白质印迹证明融合基因 hVEGF165 - FH 在 ECV304 细胞中得到表达 ( 分子质量为 24 ku 左右 ). 通过体外活性检测——— MTT 法检测 hVEGF165 - FH 对 ECV304 细胞增殖的影响,通过体外血管生成分析 hVEGF165 - FH 对内皮细胞株 ECV304 增殖的影响 . 通过体外抗栓活性检测,表明表达产物具有促进内皮细胞株增殖及加快血管生成的作用,同时显著抑制了 ADP 诱导的血小板聚集率 (P < 0.05) 并显著延长 APTT 和 TT (P < 0.05) . 实验结果表明,融合基因在内皮细胞株中得到表达,表达的融合蛋白具有 hVEGF165 和嵌合水蛭肽 (FH) 的双重活性,这为以后的融合基因治疗再狭窄的动物实验打下了良好基础 .     

水蛭素的分子生物学研究

本文从分子生物学的角度简述了蛋白酶抑制剂水蛭素的生物学和临床医学作用,结构特点,结构与功能关系,水蛭素与凝血酶之间的作用方式,以及水蛭素基因的克隆与表达。同时还指出了水蛭素基因的复杂性。水蛭素基因结构的阐明,基因的表达调控,将成为今后研究的重要方向之一。     

重组水蛭素Ⅲ分子改建及其构效关系的初步研究

采用一种新的PCR定点诱变技术成功地对野生型水蛭素Ⅲ进行了定点诱变,这种方法快速、简便,有效。通过突变,将野生型水蛭素Ⅲ分子的活性功能非必需区的指状结构顶端第33～36位的氨基酸残基替换为RGDS序列,并进行了高效分泌表达,表达产物分泌到细胞外发酵液中。改构的水蛭素突变体与野生型水蛭素Ⅲ相比,两者的抗凝血酶活性基本一致,但体外抗血小板凝集试验结果表明,前者除原有的抗凝活性外还具有显著的抗ADP诱导的血小板凝集活性,该研究为水蛭素Ⅲ分子的结构功能关系研究以及新型抗凝药物的研制打下了基础。     

融合基因Mdc-hly的构建及原核表达

构建家蝇天蚕素-人溶菌酶(Mdc-hly)融合基因,实现Mdc-hly基因在大肠杆菌中的表达。通过RT-PCR分别扩增出家蝇天蚕素和人溶菌酶的成熟肽基因序列,再利用Gene-SOEing技术构建融合基因,将融合基因克隆至pET32a表达载体,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导得到高效表达,融合蛋白分子量约为38kD。Western blotting杂交证实了表达蛋白的抗原活性。成功构建了融合其因并进行了原核表达,为进一步的生物活性研究打下基础。     

TPO模拟肽与人IgG1 Fc片段的融合表达及其生物学特性研究

依据本室获得的人TPO模拟肽序列,合成了该模拟肽的DNA序列,分别连接至4种不同长度的人IgG1 Fc基因片段的5′端,并克隆至质粒表达载体pET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得了4种重组工程菌,其中3种分别高效表达了3种不同长度的融合蛋白,而第4种工程菌未表达。表达的3种融合蛋白的分子量分别约为28kD、12kD和12kD,表达量约占菌体蛋白总量的30%左右,纯化获得了3种TPO模拟肽融合蛋白。3种融合蛋白均有较好的体外活性,维持TPO依赖细胞Ba/F3-mp1生长的EC50分别为：13、10、10 nmol/L。用血小板减少症小鼠动物模型,测定了它们的体内活性,3种融合蛋白均有升高血小板和缩短血小板恢复时间的功能,分别比TPO模拟肽活性提高了18、8、8倍;而对白细胞及红细胞无显著影响。分别用3种融合蛋白免疫BALB/c小鼠,均未刺激小鼠产生抗TPO模拟肽抗体,并显示了较好的应用潜力。      

昆虫抗菌肽的生理活性及其转基因应用前景

昆虫抗菌肽是昆虫免疫后存在于血淋巴中的一类活性肽。根据分子的结构可分为 5类 :天蚕素类、昆虫防御素、富含脯氨酸或精氨酸的抗菌肽、富含甘氨酸的抗菌肽、抗真菌肽。且具有广谱的抗菌、抗病毒、抑制肿瘤的生物活性。概述了昆虫抗菌肽的基因的克隆与表达及转基因研究方面的进展 ,并展望了抗菌肽在基因工程中的应用前景     

二倍体和四倍体杂交兰幼苗对低温胁迫的生理响应差异分析

为探究不同倍性杂交兰（Cymbidium hybrid）对低温胁迫的生理响应差异,对低温胁迫下（昼温10℃、夜温4℃）二倍体杂交兰以及四倍体杂交兰株系T1和T2幼苗叶片中脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白质、MDA和叶绿素含量,O-·2产生速率以及SOD、POD和CAT活性的动态变化进行了测定和分析;在此基础上,比较了二倍体和四倍体杂交兰的耐低温特性差异。结果显示：随着胁迫时间的延长,二倍体杂交兰和四倍体杂交兰株系T1和T2幼苗叶片中脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白质和MDA含量,O-·2产生速率以及POD和CAT活性总体呈逐渐增加的趋势;叶绿素含量呈逐渐下降的趋势;SOD活性呈先上升后下降的趋势,并分别在胁迫后第9天和第6天达到峰值。在常温（25℃）下恢复生长3d后,二倍体杂交兰和四倍体杂交兰株系T1和T2幼苗叶片中脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白质和MDA含量,O-·2产生速率以及SOD、POD和CAT活性均降低,而叶绿素含量升高。总体上,二倍体杂交兰叶片中脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白质含量以及SOD、POD和CAT活性的增幅明显小于四倍体杂交兰,MDA含量和O-·2产生速率的增幅则大于四倍体杂交兰,而叶绿素含量的降幅则明显大于四倍体杂交兰。综合分析结果表明：在低温胁迫下,四倍体杂交兰叶片中渗透调节物质含量和保护酶活性均较高,其对低温的耐性强于二倍体杂交兰。     

玉米杂种优势与几种酶活性关系

对８个杂交优势明显的玉米单交种进行过氧化物酶、过氧化氢酶活性的比较研究,结果表明：８个组合的杂种胚中过氧化物酶活性介于双亲之间,６个组合的杂种胚过氧化氨酶活性介于双亲之间,这可能与杂种中互补酶的存在有关。并测定了酸性磷酸脂酸的活性,４个组合杂种胚酶活性高于双亲,另外４个组合杂种胚活性介于双亲之间,表明酸性磷酸酯酶活性与杂种优势有一定相关性。     

抗人肿瘤坏死因子-α单链抗体与其配体的相互作用

为了在大肠杆菌中表达纯化抗人 TNF- α单链抗体并检测其结合活性与中和活性 .利用GST融合蛋白系统在大肠杆菌中表达抗人 TNF- α单链抗体 E6Sc Fv;分离包含体后进行变性和复性 ,再用亲和层析法进行纯化 ;用 ELISA法和酵母双杂交系统检测 E6Sc Fv与配体的结合 ;用 L92 9细胞检测 E6Sc Fv对人 TNF- α细胞毒作用的中和活性 .经变性 ,复性与亲和层析 ,E6Sc Fv被纯化 ,在 SDS- PAGE上为单一蛋白带 ;体外结合与中和实验表明 ,表达纯化的 E6Sc Fv可与人 TNF-α结合并中和其细胞毒活性 ;进一步用酵母双杂交系统证明当表达于细胞内时 ,E6Sc Fv仍保持了与TNF-α相结合的能力 .     

Design and synthesis of dual active neovibsanin derivatives based on a chemical structure merging method

A hybrid compound consisting of neovibsanin and trans-banglene was designed according to a structure merging method and synthesized via a sequence of key steps including a Diels–Alder cycloaddition, stereoselective alkynylation, and intramolecular oxa-Michael addition reaction. The biological activity of the synthetized acetal compound and its hemiacetal analogue was investigated in PC12 cells. These studies revealed that the designed hybrid compounds displayed neuritogenic activity. Furthermore, a relatively strong neurite outgrowth promoting activity was observed in the presence of NGF. These results suggest that the designed hybrid compound exhibited a dual activity.     

杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性测定

为获得溶血活性低、抗菌活性高的杂合抗菌肽,以家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin为母体肽,并结合毕赤酵母偏爱密码子的原则,设计出6条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽,将其命名为CC22、CC28、CC29、CC30和CC34(1),CC34,利用SOE-PCR技术合成所需的目的基因,并将其克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA,通过电击转化技术,将其转化至毕赤酵母SMD1168中,经含有Zeocin的抗性平板筛选阳性转化子,YPD液体培养72h后,经Tricine-SDS-PAGE检测出目的蛋白,然后采用高效液相色谱法对其进行纯化。检测结果显示,表达产物CC29对大肠杆菌、鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)均为25μg/ml;CC34(1)对大肠杆菌表现相对较弱的抑制作用,最小抑菌浓度为100μg/ml;CC34对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为50μg/ml;且杂合抗菌肽对有益菌均没有表现出抑制作用。6条杂合肽的溶血活性均呈现较低水平,其中表现出抗菌活性的3条抗菌肽中,以CC29的溶血活性最低,CC34(1)和CC34相对次之。结合抑菌活性,CC29和CC34的抑菌效果较为明显,从而确定溶血活性低且抗菌活性较高的CC29和CC34为新型杂合抗菌肽。     

杂合抗菌肽CecA-mil的改造及在毕赤酵母中的分泌表达

参照毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastorts)偏好密码子,改造并化学合成杂合抗菌肽CecA-mil基因,改造后的CecA-mil基因克隆到pPICZα-A载体中,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-CM,转化Pichia pastoris受体菌X-33。在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子量约1．9kD的CecA-mil杂合抗菌肽获得表达,经表达条件优化,重组酵母菌的摇瓶发酵产率可达到245μg／mL。抗菌特性研究表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,对多数G^-菌及G^ 菌均有较好的抑菌活性,特别是对氨苄青霉素抗性菌和卡那霉素抗性菌抑杀效果更好;具有热稳定性和酸稳定性。这些特点使得重组抗菌肽CecA-mil在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。     

Hyperproduction of a bifunctional hybrid protein, metapyrocatechase-protein A, by gene fusion.

A hybrid protein between metapyrocatechase and Staphylococcal protein A was produced by recombinant DNA techniques. A plasmid carrying the fusion gene that encodes the hybrid protein was constructed and expressed in E. coli. Over 70% of soluble proteins of the cell extracts was estimated to be the hybrid protein. This fusion protein is about 65,000. Both the IgG-binding activity of protein A and the metapyrocatechase activity were found in the hybrid protein. The optimum pH of metapyrocatechase in the fusion protein was at around 6.5 and Km was 1.3 X 10(-5) M. A simple immuno-enzymometric assay was developed for anti-BSA antibody using the fusion protein.     

In silico modeling and experimental evidence of coagulant protein interaction with precursors for nanoparticle functionalization

The design of novel protein–nanoparticle hybrid systems has applications in many fields of science ranging from biomedicine, catalysis, water treatment, etc. The main barrier in devising such tool is lack of adequate information or poor understanding of protein–ligand chemistry. Here, we establish a new strategy based on computational modeling for protein and precursor linkers that can decorate the nanoparticles. Moringa oleifera (MO_2.1) seed protein that has coagulation and antimicrobial properties was used. Superparamagnetic nanoparticles (SPION) with precursor ligands were used for the protein–ligand interaction studies. The molecular docking studies reveal that there are two binding sites, one is located at the core binding site; tetraethoxysilane (TEOS) or 3-aminopropyl trimethoxysilane (APTES) binds to this site while the other one is located at the side chain residues where trisodium citrate (TSC) or Si₆₀ binds to this site. The protein–ligand distance profile analysis explains the differences in functional activity of the decorated SPION. Experimentally, TSC-coated nanoparticles showed higher coagulation activity as compared to TEOS- and APTES-coated SPION. To our knowledge, this is the first report on in vitro experimental data, which endorses the computational modeling studies as a powerful tool to design novel precursors for functionalization of nanomaterials; and develop interface hybrid systems for various applications.     

Design,recombinant expression,and antibacterial activity of a novel hybrid magainin–thanatin antimicrobial peptide

Antimicrobial peptides are small molecule polypeptides with biological activity, which can avoid the drug resistance. Magainin and thanatin are antimicrobial peptides with a broad spectrum of inhibitory microbes, and the core sequence of magainin is linked to a core sequence of thanatin. Here, the hybrid magainin–thanatin (MT) antimicrobial peptide was designed through bioinformatics analysis. The recombinant MT antimicrobial peptide was successfully expressed and purified in Escherichia coli BL21 (DE3). The molecular weight of the hybrid MT antimicrobial peptide was about 3.35?kDa. Moreover, the target protein indeed has an inhibitory effect on Staphylococcus aureus, E. coli DH5α, and Bacillus subtilis, with the minimum inhibitory concentrations 16.5, 20, and 9?μM, respectively. The rational designed hybrid MT antimicrobial peptide will hopefully provide large-scale fermentable antimicrobial peptides in the industrial production in the future.     

杂交春性小麦开花结实期间叶片的衰老

用杂交春性小麦901和常规小麦品种陕229为材料,研究了杂交春性小麦901叶片衰老的进程及叶片衰老延迟的原因。研究表明,杂交春性小麦901冠层3叶片叶绿素含量,光合速率,可溶性蛋白质含量在小麦灌浆后期均高于对照常规小麦品种陕229。保护酶SOD活性高且稳定,使活性氧,自由基对细胞膜的伤害减轻,膜结构能较长时间保持健康完整,维持细胞的正常供谢,叶片的功能期延长,同化能力增强。叶片向籽粒和其它器官提供充盈的同化产物,使作物的产量和抗逆性提高。