E型肉毒毒素的分子生物学研究进展

Ｅ型肉毒毒素不同于Ａ型肉毒毒素及具有蛋白分解性的Ｂ、Ｆ型肉毒毒素,具有自身的特点。本文就Ｅ型肉毒毒素的结构、激活及作用机制、Ｅ型肉毒毒素的精制特点、基因结构及酪酸梭菌产生Ｅ型肉毒毒素的机制探讨等四个方面予以了介绍。     

首次自肉毒中毒食品中分离的一株产生E型肉毒毒素的酪酸梭菌

对某卫生防疫站委托本研究室分离病原菌的一份引起肉毒中毒的食品一＂黄豆冬瓜酱＂进行检测和病原菌的分离,从中再次检出了Ｅ型肉毒毒素并分离到一产毒菌种,对该菌种的生物学及生化学特性进行检查,并检测其毒素基因（ＰＣＲ试验）。结果：该分离菌能产生Ｅ型肉毒毒素,ＰＣＲ检测结果也证明其具有Ｅ型肉毒神经毒素基因,但其多项生化特性与Ｅ型肉毒梭菌有明显差异,而与酪酸梭菌完全一致。结果说明该分离菌系产生Ｅ型肉毒毒素的酪酸梭菌,而非Ｅ型肉毒梭菌。由酪酸梭菌引起的食物中毒型肉毒中毒并从中毒食品中分离到该病原菌,这在国际上尚属首次报告。     

肉毒毒素作用机制的研究进展

肉毒毒素(botulinum toxin,BTX)是肉毒梭状芽胞杆菌在生长繁殖过程中产生的一种外毒素,其通过抑制神经递质的释放而引起肌肉松弛型麻痹。在世界范围内,肉毒中毒的案例时有发生,病情严重的患者最终因呼吸衰竭而死亡。肉毒毒素相关产品在临床痉挛性疾病、腺体分泌过度、神经性疼痛的治疗及美容除皱等领域展现出广阔的应用前景。因而,肉毒毒素作用机制的研究在肉毒中毒的治疗以及临床新适应症的开发等方面具有重要意义。就肉毒毒素跨越小肠上皮细胞屏障的吸收及神经毒性作用机制的研究现状作一概述。     

肉毒毒素结构及其重组疫苗的相关研究进展

肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,有7种血清型(A～G).肉毒毒素属神经强毒,是目前已知的毒性最强的细菌蛋白质.作为重要的生物战剂之一,对肉毒毒素的研究已经相当深入,基本明确了各型肉毒毒素的基因序列、同源性和三维结构及毒素作用的本质和机理.随着国际恐怖活动的日益猖獗,针对肉毒毒素的检测和预防也备受关注,对其疫苗的探索已成为研究的焦点.本扼要介绍了肉毒毒素的结构、作用机制及其疫苗的相关研究进展.     

A型肉毒聚合类毒素的制备及免疫原性研究

通过制备A型肉毒聚合类毒素,研究获得较好的免疫原性和反应原性的方法.通过碳二亚胺法,聚合A型肉毒类毒素,免疫小鼠,用ELISA检测抗体,成功地制备了A型肉毒聚合类毒素,免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性,研究A型肉毒聚合类毒素抗原的作用机制,获得具有中和活性的保护性抗体,对肉毒毒素中毒的防治具有重要意...     

沿微山湖地区神经毒素原性酪酸梭菌的土壤分布调查

为了解神经毒素原性酪酸梭菌在微山湖地区土壤的分布情况,我们采集了该地区的土壤样品进行调查。５０份土样培养上清中,有１８份（３６％）检出了肉毒毒素,经中和试验证实均为Ｅ型。从其中的７份阳性样品中分离到产毒菌株,对分离菌株进行毒性测定、生化特性检查及其神经毒素基因的ＰＣＲ检测,所有菌株均具有Ｅ型肉毒神经毒素基因并产生相应毒素,但其生化特性与Ｅ型肉毒梭菌不同,而与酪酸梭菌一致。结果说明沿微山湖地区土壤中确实存在神经毒素原性酪酸梭菌,而且阳性率很高。对神经毒素原性酪酸梭菌的分布进行流行病学调查并从土壤中分离到该病原菌,这在国际上尚属首次。     

我国及部分国家B型肉毒毒素的中毒情况

肉毒毒素是自然界中已知毒性最强的毒素,通常被分为A～G共7个血清型,其中A、B、E型是最常见的人类中毒型别。肉毒中毒的流行特点与菌体的地域分布、各地居民的饮食习惯和社会活动都有一定关系。目前,除南极洲外的世界各大洲均有B型肉毒中毒的报道。我国、日本及欧洲B型肉毒中毒主要为家庭自制食物引发的食源性中毒,而美国则主要为婴儿肉毒中毒。近年来,创口型B型肉毒中毒与"注射型吸毒人员"的关联引起了研究者的注意。为了加深对B型肉毒中毒的了解,我们对我国及部分国家和地区的B型肉毒中毒情况做简要介绍。     

治疗用A型肉毒毒素的制备及其质量控制

我国治疗用Ａ型肉毒毒素采用酸等电点沉淀,磷酸盐提取,核糖核酸酶处理,ＤＥＡＥ Ａ５０离子交换层析,硫酸铵浓缩及自然结晶等程序从Ａ型肉毒梭菌培养物中提取,并经稀释、冻干而成。它毒力强、纯度高、性能稳定,宜于长期保存。经生化、免疫学测定,毒素系神经毒素和血凝素的复合体,纯度为２５～３．０×１０７ＬＤ５０（小鼠,下同）／ｍｇｐｒ,ＯＤ２６０／ＯＤ２８０≤０．５５不仅达到了美国ＦＤＡ对注射用Ａ型肉毒毒素的质量要求,而且在冻干损失,稳定性方面还优于美国制品。     

一株D型肉毒梭菌的分离和鉴定

从我国东海地区的海泥培养物中,分离出一株厌氧性芽孢杆菌。经细菌学、毒素血清学．细菌代谢产物的气相色谱分析及DNA中G+ct001％测定,鉴定为D型肉毒梭菌,编号为D85501。与国际参考菌株D359对照,D85 501菌株具有D型肉毒梭菌的总特性,还有自身的特点,是D型肉毒梭菌中的一新株,是我国分离的首株D型肉毒梭菌。     

A型肉毒毒素轻链基因的克隆及其结构分析

以献报道的A型肉毒毒素基因全序列为标准,设计并合成一对引物,自肉毒梭菌基因组中扩增出肉毒毒素轻链基因片段,并将扩增产物与pGEM—T载体在体外连接,构建测序重组质粒,进行测序和基因结构分析。PCR扩增获得了产物为1 364bp的DNA片段,测序结果与DNA数据库对照检索分析证明,此基因片段与GenBank中的A型肉毒毒素LC基因的一致性达99．9％以上,可以认为克隆的基因为A型肉毒毒素LC基因。     

B型肉毒毒素重链抗原表位的预测及表位合成肽抗原性的检测

目的:预测B型肉毒毒素蛋白抗原表位,研究表位合成肽的生物学活性。方法:利用生物信息学,结合Anthwine分析软件及网络平台,预测B型肉毒毒素蛋白重链的B细胞抗原表位。人工合成4条(P1,P2,P3,P4)表位多肽,与抗B型肉毒毒素类毒素的马血清反应;采用腹腔注射的方式用合成肽免疫BALB/c小鼠,检测免疫血清与合成肽的结合;对免疫小鼠腹腔注射B型肉毒毒素。结果:合成的多肽能与抗B型肉毒毒素的类毒素的马血清结合;多肽免疫小鼠后能产生针对多肽的抗体,其中P1、P3、P4产生的抗体对受毒素攻击的小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。     

A型肉毒毒素轻链胞内持留模型的建立

[目的] 建立A型肉毒毒素轻链胞内持留模型来模拟A型肉毒毒素引起的长期中毒。[方法] 设计构建pcDNA3.1-ALC-GFP重组质粒,提取质粒进行PCR验证,并将其转染进Nureo-2a细胞中表达,利用Western Blot与细胞免疫荧光分析验证ALC-GFP的表达情况及其在细胞内的长时间持留,建立A型肉毒毒素轻链的胞内持留模型,并将该模型用于抗肉毒药物的筛选。[结果] 成功构建pcDNA3.1-ALC-GFP重组质粒并将其转染进Nureo-2a细胞中,验证了ALC-GFP在细胞内具有长时间持留性,成功建立了A型肉毒毒素轻链胞内持留模型,并利用该模型筛选出潜在抗肉毒药物CB3。[结论] 成功建立了A型肉毒毒素轻链胞内持留模型,并初步应用于CS1,CE2和CB3药物筛选,为A型肉毒毒素长期中毒的解毒研究奠定了基础。     

用酶联免疫吸附试验检测肉毒毒素

<正>近年来建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)给肉毒毒素的快速检测增加了一项重要的手段。某些酶既可结合于抗原(如竞争性酶联免疫吸附试验中的毒素),也可结合于抗体(如爽心法酶联免疫吸附试验中的IgG)。考虑到肉毒毒素是一种强毒物质,故更多地用后一标记方法。藉此已对A、B、E、G型肉毒毒素及A、B、E三型混合毒素,C和D型的毒素有关抗原和毒性的关系,一些肉毒梭     

C型肉毒毒素与C型肉毒中毒

本文介绍了Ｃ型肉毒毒素的纯化、生物学特性,并从流行病学角度对动物Ｃ型肉毒中毒的发生、中毒机理及临床表现、诊断、治疗及预防等进行了概述。对近年来Ｃ型肉毒毒素在分子水平、作用机理等方面的研究进展做了简要介绍。     

中国的E型肉毒中毒及其病原菌的特点

本世纪３０年代中期,几乎同时在原苏联与美国分别发现海鱼引起的肉毒中毒并认定其病原菌为一新型即Ｅ型的肉毒梭菌之后,世界各地也相继发现Ｅ型肉毒中毒发生,且多为沿海地区居民因食用处理不当的鱼,鱼子及各种海栖动物肉所导致。而我国的Ｅ型肉毒中毒及其病原菌的地理分布状态以及中毒诱因等方面在国际间具有某些独特之处。在我国,除大连新金县罐头鱼引起的一起Ｅ型肉毒中毒之外,Ｅ型中毒主要发生在海拔４～５千米的青藏高原或远隔海域的东北平原和华北平原;中毒均为食物中毒型,原因食品及发病因素基本上都是生吃冬藏肉或豆谷类发酵食品。我国的Ｅ型肉毒梭菌也多分布于黄土高原或内陆平原,而在沿海的泥沙和鱼类中则很少能检出该菌。华北平原微山湖周边几个县发生的３起食物中毒型Ｅ型肉毒中毒已经证实均系酪酸梭菌产生的Ｅ型神经毒素所引起,并又查明该湖周围土壤中确有Ｅ型神经毒素原性酪酸梭菌存在,此乃世界上最早的发现     

肉毒毒素研究进展

肉毒毒素是肉毒梭菌产生的一种神经毒素,能够通过抑制神经肌肉接头处的乙酰胆碱释放而引起肌肉麻痹.肉毒毒素在培养液中以复合物形式存在,其中的毒性组分由3个非同源性结构域组成,是一种新型的金属蛋白酶.不同血清型的肉毒毒素能够特异性地作用于不同底物,这些底物在神经细胞的胞外分泌过程中发挥重要作用.肉毒毒素在胞吞胞吐机制的研究以及临床医学应用方面具有宝贵的价值.     

IEF纯化重组A型肉毒毒素保护性抗原

在大肠杆菌中高效表达的重组A型肉毒毒素保护性抗原（rBoNTaH468),是以包涵体形式存在,将表达菌株发酵后,裂解菌体,制备包涵体,溶解后的包涵体溶液经样品处理,通过等地电聚焦制备型电泳纯化,纯化的重组A型肉毒毒素保护性抗原（rBoNTaH468)纯度高于90%,产量及回收率高,纯化的重组表达产物酶联检测具有结合活性,这为下一步A型肉毒毒素抗毒素的研制打下基础。     

肉毒杆菌二元毒素和细胞外酶

对肉毒中毒和肉毒毒蛋白的研究已有近百年历史,肉毒杆菌神经毒素（ＢｏＮＴ）作用机制研究的进展已使它成分为分析神经递质释放的胞吐分子机制和用于临床治疗的有用工具。近年发现,肉毒梭状芽胞杆菌Ｃ和Ｄ型菌株除分泌ＢｏＮＴ外,尚合成另外两类与ＢｏＮＴ结构和生物活必完全不同的蛋白质,肉毒二元毒素和肉毒细胞外酶,它们分别影响细胞骨架和细胞的生长发育,也成为分析相关生命过程的有效工具药,本文综述了这两类蛋白质的有关     

A型肉毒神经毒素基因的PCR检测

目的:建立快速筛查A型肉毒毒素的PCR方法。方法:根据GenBank中报道的肉毒毒素基因序列,综合应用多种生物软件分析设计特异的检测引物,从提取的基因组DNA、热裂解产物和菌液等不同形式的模板中扩增大小为457bp的A型肉毒毒素特异基因片段,以肉毒梭菌其他血清型及破伤风梭菌为对照。结果:检测方法无交叉反应,灵敏度可达10pgDNA,3×103个菌。结论:建立的检测方法特异性强、灵敏度高,可以用于A型肉毒毒素基因的快速筛查。     

C型肉毒毒素的制备及类毒素保护力初探

将C型肉毒梭菌经适宜条件的产毒培养后纯化,并进行相关鉴定。制备的C型肉毒毒素用分段脱毒法脱毒,并进行类毒素保护力的初步研究。以不同蛋白含量C型肉毒类毒素免疫小鼠后攻毒,结果显示,蛋白含量为0.625μg的类毒素免疫2针或蛋白含量为1.25μg的类毒素免疫1针均可保护50LD50的C型肉毒毒素攻击。蛋白含量为5μg的C型肉毒类毒素与福氏不完全佐剂配制的抗原免疫小鼠3次所得抗血清的保护力(Anti LD50/ml)为4.3×104。说明用该纯化工艺制备的C型肉毒类毒素具有很好的免疫原性,作为抗原成分用于C型肉毒疫苗和C型肉毒抗毒素的研究和生产具有较好的应用潜力。