固定化Ralstonia metallidurans CH34降解苯酚的研究*

将既能耐抗重金属又能降解苯酚的细菌Ralstonia m etalliduransCH34固定化以提高其降酚效率。首先通过正交实验,得到了固定化该菌种的最优制备条件,然后对固定化细胞的降酚效果进行了研究。结果表明,固定化R.m etalliduransCH34的降酚效果明显优于游离细胞;抗重金属毒性方面也有较大提高;在加入额外碳源(甲苯,柠檬酸)情况下,固定化R.m etalliduransCH34进行苯酚降解时所受影响明显要小于游离态菌。     

Ralastonia metallidurans CH34苯酚降解特性的研究

RalstoniametalliduransCH34是从一家锌工厂的沉积物中分离筛选到的一株细菌。对其降解苯酚的特性进行了研究。结果表明R.metalliduransCH34具有很高的降解苯酚的能力,其降解苯酚的速率常数为0.33,降解苯酚的最适条件为pH7.0,温度30℃,装液量20%(v/v)。在高浓度重金属存在的条件下,R.metalliduransCH34仍保持较高的苯酚降解活力。柠檬酸钠、琥珀酸则能促进其对苯酚的降解。     

外源性双链RNA对小鼠卵母细胞basonuclin基因表达的影响

在植物及低等动物线虫中, 引入外源性双链RNA(dsRNA)会导致细胞中同源mRNA降解, 从而干扰其内源基因的表达, 这可能是有机体防范病毒或转座子诱导DNA突变的一种生理机制, 称为RNA干涉(RNA interference, RNAi). 利用RNAi研究basonuclin基因在卵母细胞发生过程中的功能. 将basonuclin特异的dsRNA导入小鼠生发泡期卵母细胞, 可有效降低其mRNA的丰度, 这种降解作用与dsRNA的浓度及作用时间成正比, 但不影响非同源基因的表达, 证明basonuclin dsRNA能特异识别、降解其内源基因的转录产物. 免疫组化实验显示, dsRNA能降低卵母细胞中basonuclin蛋白的水平, 但其效率不如RNAi对tPA及cMos基因活性的抑制, 这可能是由于basonuclin蛋白的半衰期较长, 而生发泡期卵母细胞在体外存活时间较短. 结果表明, dsRNA能阻抑卵母细胞中同源基因的表达, 其作用相当于基因敲除. 质粒表达的发夹环型dsRNA也可以有效降解basonuclin转录产物, 这为研究basonuclin在卵母细胞发育早期的功能提供了新的手段.     

Paenibacillus massiliensis T7固氮基因簇nifBHDKENX的克隆、序列分析及铵和氧对nifB启动子的调控

Paenibacillus massiliensis T7是我室从北京郊区分离的一株革兰氏阳性、产芽孢的固氮菌. 根据GenBank中已发表的多种固氮生物nifH基因序列, 在其保守区域设计一对简并引物, PCR扩增获得324 bp的nifH片段. 用地高辛标记该片段为探针, 对EcoRⅠ和PstⅠ消化的P. massiliensis T7染色体DNA进行Southern杂交, 结果DNA/EcoRⅠ杂交道1.1 kb和9 kb处, DNA/PstⅠ杂交道1.3 kb和8 kb处分别有两条杂交带, 从而初步判断nifH可能有两个拷贝. 在324 bp nifH片段的基础上, 采用反向PCR扩增的方法, 获得了purD和nifBHDKENX基因. 在nifB的上游有一个类似σ⁵⁴型启动子的保守序列, 在该启动子上游有一个类似激活蛋白NifA结合位点. 分析表明, nifBHDKENX可能组成一个转录单元, 共用nifB上游的启动子. 将nifB启动子与报告基因lacZ相融合, 构建成表达载体pnifB-LacZ, 并转化到P. massiliensis T7中, 研究铵和氧对该启动子的表达调控. 结果表明, 在无氧条件下, 铵浓度为0%时, β-半乳糖苷酶的活性最高, 随着铵浓度的增加, 酶活性并没有明显的下降过程, 即使铵浓度达80 mmol/L时, 酶活也相当于无铵时的73.12%, 说明铵对nifB启动子有微弱的抑制作用, 而铵浓度一定, 氧浓度3%时, β-半乳糖苷酶活性最高, 提高氧浓度则酶活性开始下降, 当氧浓度高于20%时, β-半乳糖苷酶活性仅几个Miller单位, 说明氧对nifB启动子有明显的抑制作用.     

类核环形结构在耐辐射球菌电离辐射抗性中不起主要作用

近来基于透射电子显微镜研究的论点“耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans) R1类核致密的环形结构是其极端辐射抗性的关键因素”已引起广泛争议. 本文在以前研究基础上系统地比较了野生型R1菌株、pprI (DR0167)基因突变株YR1及pprI基因功能补偿株在电离辐射前后的类核结构的形态差异. 荧光显微镜观察结果显示: (ⅰ) 具有超强电离辐射抗性的野生型菌株R1细胞类核主要呈现紧凑的环形结构, 而同样有环形类核结构的pprI突变株YR1细胞却对辐射非常敏感; (ⅱ) 2个pprI基因功能补偿株, YR1001(pprI全基因功能补偿株)类核绝大多数呈现絮乱松散的不规则形态, YR1002(pprI部分基因功能补偿株)呈现约60%左右的环形类核结构, 这两个菌株都具有与野生型R1同样的电离辐射抗性; (ⅲ) 另一pprI部分基因功能补偿株YR1004 (敲除pprI基因3′端333个碱基对)对电离辐射极其敏感, 其约60%左右的细胞含有环形的类核结构. 上述结果表明, 耐辐射球菌类核的环形结构在辐射极端抗性中不起主要作用.     

固定化Ralstonia metallidurans CH34在三相流化床中降解苯酚的研究

通过探索固定化细菌Ralstonia metallidurans CH34在三相流化反应器中降解苯酚的反应条件,对固定化细胞处理工业废水进行模拟研究,以期提高R.metallidurans CH34降解苯酚的能力和效率。结果表明,固定化R.metallidurans CH34在三相流化反应器中明显提高了降解苯酚的能力,耐抗金属性也有较大的提高,而且能够在模拟工业废水中批次培养3-4次,其降酚能力退化并不明显。这为R.metallidurans CH34实际应用提供了可靠的基础。     

苯酚降解菌的筛选及其降解特性的初步研究

从某印染厂下水道的污泥中分离到一株能高效降解苯酚的菌株ph₁₆,经初步鉴定为微球菌属 (Micrococcussp )。该菌株最高可耐受 1.5g L左右的苯酚 ,对苯酚降解最适条件为pH7.0 ,温度 35℃ ,苯酚浓度为1.0g/L ,时间为 36h,降解率可达 99.6 %。试验还表明Hg⁺ 、Co²⁺ 、Ag²⁺ 等重金属离子对该菌株降解苯酚能力有不同程度的抑制作用。并对其降解动力学作了初步探讨。     

青霉素G酰化酶调节基因的定位

为了定位青霉素G酰化酶的调节基因,从质粒Ppa6克隆了一系列青霉索G酰化酶基因(pac)的片段,将这些重组质粒转化E.coli D816,测定克隆片段对pac表达的影响。如果克隆片段含有完整的调节基因(pacR)。诱导剂不能使由高拷贝pacR表达的阻抑物失活,部分阻抑物结合pac操纵基困,阻碍RNA聚合酶对加pac的转录,因此pac的表达量降低。发酵结果表明,阻抑物可能是由pac结构基因内部的ORFⅡ编码的蛋白因子。     

籼稻半矮秆基因sd-t(t)的遗传定位及定位区间物理距离的估计

矮秆和半矮秆基因的利用及作用机制一直是作物育种和分子遗传研究的重要内容. sd-t(t)是从籼稻矮秆材料矮泰引-2中发现的一个与sd-1不等位的新半矮秆基因.利用由矮泰引-2与无叶舌标志基因系B30杂交产生的包含474个单株的F₂群体, 将sd-t(t)基因定位在水稻第4染色体上RFLP标记R514和R1408B之间, 距R514和 R1408B的遗传距离分别为1.1和4.5 cM. 利用水稻品系IRBB56 的BAC文库构建了sd-t(t)位点的跨叠克隆群, 并确定 R514与R1408B之间的物理距离大约为147 kb, 为进一步克隆sd-t(t)基因奠定了基础.     

水稻Rac家族新成员osRACB基因的克隆及结构分析

Rac基因是植物中惟一的一类分布广泛的信号GTP结合蛋白, 它在整个植物生长发育过程中起着极为重要的作用. 应用本实验室已有的水稻光周期育性转换相关基因osRACD为探针, 在低严谨杂交条件下, 筛选农垦58N-LD雌雄蕊形成期(第Ⅳ期)幼穗cDNA文库, 获得一水稻Rac家族新基因. 经同源性比较和序列分析显示, 该基因与玉米Rac家族成员RACB基因具有93%的核苷酸同源性, 且两者氨基酸序列长度相等, 仅存在一个氨基酸残基差异, 故命名新基因为osRACD. 进一步应用PCR技术, 以农垦58N基因组DNA为模板扩增得到长度为2930 bp的osRACB基因转录区核苷酸序列, 其结构包含7个外显子和6个内含子, 同时, 通过基因组文库筛选获得osRACB基因的启动区序列. Southern杂交分析表明osRACB基因同其他Rac基因相似, 是低拷贝基因. RT-PCR检测显示osRACB基因在水稻根、茎、叶中均有一定的表达, 但在茎中表达量最高. 此外, 还以人Rac1蛋白为模板, 利用InsightII软件包下的Homology, Discover等模块对osRACB蛋白进行了三级结构预测.     

水稻小穗分化调控基因fzp(t)的遗传分析和分子标记定位

从V20B/花1B杂交后代中发现了水稻小穗分化受阻的突变体fzp. fzp株叶形态正常, 但植株分蘖数明显减少, 最显著的变异是fzp植株的小穗分化完全被阻断, 在正常植株枝梗分化为小穗的部位, fzp植株却形成一团枝梗. 遗传分析表明,fzp受一对隐性基因控制, 其相应基因拟名为fzp(t). 显然fzp(t)是控制小穗分化的关键基因. 在一些F2群体中, 因遗传背景发生改变, 部分突变型植株表现为“中间类型”, 推测可能是冗余基因或其他修饰基因、互作基因的作用. 采用微卫星标记技术和BSA分析方法, 将突变基因fzp(t)定位于第7染色体上的长臂末端, 其中RM172和RM248位于fzp(t)一侧, 它们与fzp(t)的遗传图距分别为3.3和6.4 cM; RM18和RM234位于fzp(t)的另一侧, 与fzp(t)的遗传距离分别为23.1和25.3 cM. 研究结果为进一步对该基因的克隆和功能研究奠定了基础.     

水稻黄单胞细菌Harpin蛋白的遗传多样性及其诱导烟草过敏反应和抗病性功能

利用PCR方法从水稻黄单胞细菌(Xanthomonas oryzae)两个致病变种(pv. oryzae和pv. oryzicola)的12个菌株中, 扩增出了编码诱导植物过敏反应蛋白激发子Harpin的3类hrfA (hypersensitive response functioning factor A)同源基因hrf1, hrf2和hrf3. 同源性分析表明, 这些同源基因推测的编码产物均富含甘氨酸, 缺乏酪氨酸, 在序列的第45位附近的氨基酸都有一个半胱氨酸. Harpin_Xoo由来源于水稻白叶枯病菌的hrfA基因编码, 产物包括两类, 一类代表菌株为JxoⅢ, 其中GGG-GG基序的重复数为3个, 分子量为15.6 kD; 另一类代表菌株为Pxo112, 产物中GGG-GG基序的重复数为4个, 分子量为15.9 kD, 这两个基因分别命名为hrf1和hrf3. Harpin_Xooc由来源于水稻条斑病细菌的hrfA基因编码, 代表菌株为RS105, 其中GGG-GG重复数为2个, 分子量为15.3 kD, 水稻黄单胞菌Harpin分子中的一个半胱氨酸残基是其特有的. 将这3类基因与已报道的hpa1和xop1基因编码的氨基酸序列进行聚类分析, 结果可以将其分为4类, 来源于水稻黄单胞菌的Harpin_Xoo和Harpin_Xooc被分在相邻的两类中. 对3种产物进行比较研究结果, 在相同条件下3个代表菌株JxoⅢ, RS105和Pxo112的hrfA基因(hrf1, hrf2和hrf3)表达蛋白的相对浓度分别为: 0.389, 0.530, 0.083 mg/mL. hrf1, hrf2和hrf3在大肠杆菌(Bl21)中的表达产物(Harpins)在烟草上均能激发过敏反应和诱导抗病性, 其生物活性依次为Hrf2, Hrf1和Hrf3.     

采用苯酚羟化酶基因特异引物检测苯酚降解菌

根据苯酚羟化酶基因高度保守序列设计了一对该基因的特异PCR引物。采用该特异引物从苯酚降解菌醋酸钙不动杆菌 (Acinetobactercalcoaceticus)PHEA 2的总DNA中扩增到唯一一条大小为 684bp的片段。该DNA片段与已知的A .calcoaceticusNCIB82 50的苯酚羟化酶基因具有高度的同源性 ,其核苷酸序列的同源性为 84% ,推导的氨基酸序列的同源性为 98%。对苯酚和非苯酚降解菌株的PCR扩增结果表明 :所有苯酚降解菌均能扩增出 684bp的特征片段 ,而非苯酚降解菌则无PCR条带。对炼焦废水中的细菌群落进行PCR扩增和生化特性检测表明 :显示 684bp特征片段的菌株均具有苯酚降解特性。上述结果表明 ,利用苯酚羟化酶基因的特异引物可对环境中的苯酚降解菌株进行准确快速的PCR检测。     

以染料为底物的Trametes hirsuta降解反应体系的建立*

建立Trameteshirsuta的生长繁殖和对模式染料比布列希猩红脱色降解的反应体系 ,研究表明 :菌的生长与降解活动的适宜温度为 30℃ ,静培养 ;培养基组分对脱色降解的影响不大 ;从便于观察和缩短反应周期考虑 ,土豆液体培养基有明显的优点 ,可作为建立Trameteshirsuta反应体系的首选培养基。菌对比布列希猩红、直接深蓝L 3RB、活性艳蓝X BR、碱性紫 5BN和亚甲基蓝等均有较好的脱色降解效果。     

对水稻MADS-box基因M79的表达模式和功能的分析

利用简并引物和T引物,通过RT-PCR, 从水稻减数分裂时期的小花中扩增并克隆出一个MADS-box基因M79,序列分析表明M79与OsMADS7在DNA水平上同源性达到97.5%,推导的蛋白序列同源性却只有91.0%.M79的转录本有5个不同的 poly (A)添加位点,它同OsMADS7一样在水稻中为单拷贝基因,也定位在水稻的第8号染色体上.M79仅在花器官中表达,其表达从减数分裂前期开始贯穿整个花的发育各时期,并且成熟雌蕊中的表达量比成熟雄蕊中多.对两代转基因水稻的分析表明,M79涉及水稻的花时控制,异位表达可使烟草的花期提前,并且还可能参与控制营养生长中的分枝以形成更多的花芽.     

E.aero高产1.3-丙二醇菌株发酵条件的研究(Ⅱ)

建立了1.3-丙二醇高产菌株(Enterobacter aerogenes简写为E.aero-N-56)1.3-PD厌氧发酵最适pH值、温度、时间、接种量分别为7.0、30℃、48h、9％;在最适发酵条件下,30L发酵罐中E.aero-N-56菌株1.3-PD产量为47.36g/L,生产率为23.68g/L·d。     

棉花微管蛋白基因GhTub1在纤维细胞中的特异表达

以陆地棉(Gossypium hirsutum )纤维发育前期和中期的胚珠及纤维细胞为材料构建cDNA文库, 通过ESTs分析获得了一个β-微管蛋白家族成员(GhTub1). 以该cDNA的3′-UTR为探针, 利用Northern杂交方法, 对GhTub1基因在棉花不同器官及棉纤维不同发育阶段的表达进行了分析, 发现该基因的表达具有棉纤维细胞特异性. 在纤维发育过程中, GhTub1转录产物的累积主要发生在纤维细胞延伸阶段, 在纤维延伸速度最快时达到高峰. 利用裂殖酵母系统, 对GhTub1的细胞内功能进行了初步分析, 发现该基因在酵母中过量表达能使其细胞显著伸长或分支. 这些实验结果暗示GhTub1基因可能在纤维细胞的极性延伸中具有功能.     

基于细胞色素b基因片段序列研究中国近海石斑鱼类系统进化关系

石斑鱼的分类一直是鱼类系统分类学中的一个难题. 为探讨中国近海石斑鱼类系统进化关系, 通过PCR扩增获得了石斑鱼亚科(Epinephelinae)6属28个种类的线粒体细胞色素b基因片段序列. 采用多个生物软件对序列变异和碱基组成进行分析, 计算了Kimura 2-parameter遗传距离、转换/颠换比等遗传信息指数, 并结合GenBank上石斑鱼属的同源序列, 以东洋鲈(Niphon spinosus)、真鲷(Pagrus major)等为外群构建NJ, MP, ML和ME系统树. 从分子系统学的角度并结合形态学特征得出了如下结果: (i) 鳃棘鲈属(Plectropomus)最先分化, 是石斑鱼亚科中原始的类群; (ii) 侧牙鲈属(Variola)与九棘鲈属(Cephalopholis)具有较近的亲缘关系; (iii) 九棘鲈属是一个单系群, 并且较石斑鱼属(Epinephelus)原始; (iv) 宽额鲈(Promicrops lanceolatus)和驼背鲈(Cromileptes altivelis)可以归入石斑鱼属; (v) 石斑鱼属内部存在两个平行进化的姐妹分支.     

转基因水稻中转录水平cry1Ab 基因的沉默及其阶段复活

以田间环境释放条件下农杆菌介导法转化而成的转cry1Ab 基因水稻为研究对象, 利用GUS组织化学染色法、Western杂交技术, 在不抗虫转基因中8215株系后代中筛选到一个无cry1Ab 蛋白表达产物株系. 分子杂交结果证实, 转基因cry1Ab 在中8215株系后代中发生了转录水平沉默, 整合过程中基因重排使两个拷贝的ubiquitin启动子同时插入到水稻基因组中. 甲基化分析证实ubiquitin启动子区域发生了甲基化, 从而导致cry1Ab基因沉默. 利用去甲基化试剂5-氮胞苷处理转基因沉默水稻种子, 并在苗期、分蘖期、孕穗期、灌浆期及成熟期检测了其对沉默基因的复活效应, 结果表明：5-氮胞苷处理使沉默的cry1Ab 基因在灌浆期恢复表达活性, 复活率约为8%~30%, 且以低浓度(45 mg/L处理1, 2 d)处理的复活率及恢复表达水平较高, 复活基因表达的cry1Ab 蛋白最高可达可溶性总蛋白的0.147%.     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。