辐照外源DNA导入番茄两种同工酶的研究

采用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳对辐照外源DNA导入番茄的受体后代进行过氧化物酶和细胞色素氧化酶同工酶研究,并对供体叶形在受体后代中的表达和后代株高进行分析。研究表明,多数受体后代与受体对照的两种同工酶图谱差异较大而与供体对照的两种同工酶图谱较为相似,这与它们在外观性状（叶形和株高）上的差异是吻合的。受体后代与体供在同工酶图谱上的相似性以及供体外观性状在受体后代的表达表明了外源DNA已经导入受体,并得到整合表达,说明辐照外源DNA导入技术是改良番茄品种,丰富育种材料的一条有效途径,在番茄选育新品种方面有良好的应用前景。     

辐照外源DNA导入番茄研究——D1、D2代分析

辐照外源DNA导入番茄后,供体叶形不但在D1代上得到表达,而且能遗传到D2代。并且在D1代,其果形、果实大小以及Vc含量等都有明显变化。为验证该技术的效果和重复性,又进行了第二期辐照外源DNA导入番茄试验,发现在D1代幼苗中,供体的显性基因正常叶形,仍有一定的几率在受体中得到表达。结果与第一期试验相同。野生种番茄DNA龙辐照作供体导入后,也获得了野生种叶形在受体中得到表达的D1代植株,说明辐照外源DNA导入番茄技术效果好,重复性好,便于进行远缘杂交。     

辐照外源DNA导入番茄研究——D_1、D_2代分析

辐照外源DNA导入番茄后 ,供体叶形不但在D1 代上得到表达 ,而且能遗传到D2 代。并且在D1 代 ,其果形、果实大小以及VC 含量等都有明显变化。为验证该技术的效果和重复性 ,又进行了第二期辐照外源DNA导入番茄试验 ,发现在D1 代幼苗中 ,供体的显性基因正常叶形 ,仍有一定的几率在受体中得到表达 ,结果与第一期试验相同。野生种番茄DNA经辐照作供体导入后 ,也获得了野生种叶形在受体中得到表达的D1 代植株。说明辐照外源DNA导入番茄技术效果好 ,重复性好 ,便于进行远缘杂交。     

丛枝菌根菌丝桥介导的番茄植株根系间抗病信号的传递

菌根菌丝桥是植物间在地下进行物质交流的通道, 但它能否作为植物间地下化学通讯的通道来传递抗病信号则缺乏研究. 本文利用丛枝菌根真菌（AMF）摩西球囊霉在供体与受体番茄植株间建立菌丝桥, 对供体植株接种早疫病病原菌茄链格孢菌, 研究供体与受体番茄植株根系间是否存在抗病信号的传递. 荧光定量PCR检测表明, AMF侵染后的供体番茄植株再接种病原菌, 其根系中苯丙氨酸解氨酶基因（PAL)、脂氧合酶基因（LOX）和几丁质酶基因（PR₃）的转录水平显著高于仅接种病原菌、未接种病原菌和AMF, 以及只接种AMF的番茄植株. 更重要的是, 与供体有菌丝桥连接的受体番茄根系中PAL、LOX和PR₃的基因的表达量也显著高于无菌丝桥连接、菌丝桥连接被阻断以及有菌丝桥连接但供体植物未接种病原菌的处理,3个基因最高转录水平达到无菌丝桥连接对照受体植物的4.2、4.5和3.5倍. 此外, 供体植株根系启动防御反应的时间（18和65 h）比受体（100和140 h）早. 表明病原菌诱导番茄供体根系产生的抗病信号可以通过菌丝桥传递到受体根系.     

60Co辐照对水稻基因组DNA诱变的分子生物学效应

以水稻品种农林8号及其60Co γ射线辐照突变体农林8号m为研究材料,选用360个10碱基寡核苷酸随机引物,利用随机扩增多态性DNA标记技术筛选出1个引物OPG18在农林8号和农林8号m之间表现出共显性的多态性.通过对该共显性标记的克隆和序列分析表明,突变体农林8号m与农林8号相比有29 bp DNA片段的缺失.研究结果为60Co γ射线辐照导致植物基因组DNA缺失提供了一个最直接明确的证据.     

多序列比对的量子点荧光探针检测金黄色葡萄球菌的研究

利用以量子点（Quantum dot,QD）作为供体、有机荧光染料作为受体的荧光能量共振转移（Fluores—cence resonance energy transfer,FRET）体系检测核酸等大分子是一种非常重要的检测手段。本文构建了一种检测金黄色葡萄球菌种特异性16SrDNA的新方法。此方法以羧基修饰的525nm量子点与氨基修饰的DNA在EDC的作用下通过脱水连接形成QD—DNA复合物作为荧光能量共振转移体系的供体、有机荧光基团ROX修饰的DNA作为荧光能量共振转移体系的受体组成能与金黄色葡萄球菌种特异性16SrDNA杂交的检测探针。当探针与靶序列发生杂交时,作为供体的525nmQD与作为受体的ROX之间的距离被缩短至能有效发生荧光能量共振转移的距离之内。此时,以不能致ROX发光的波长激发量子点发光,其荧光强度下降,而ROX的荧光强度上升。在不存在靶序列的情况下,不会发生这种荧光强度的变化。QD与ROX荧光强度的变化是实现本检测体系快速、简单的重要保证。     

转基因插入对水稻花粉活力和杂交结实的影响

以花粉活力和杂交结实率评价转基因插入对水稻品种异交潜力的影响.选用含bar、crylAb、BADH和Xa21等4种基因的5份转基因水稻品系研究转基因插入对转基因受体品种花粉离体萌发率的影响.结果表明,不同受体品种花粉离体萌发率差异显著;转基因水稻花粉离体萌发率在0.416～0.584间,与受体品种(0.004～0.574)相近;转基因品种与相应受体品种间花粉离体萌发率差异不显著.对所选配的26个人工杂交组合杂种结实调查表明,bar、crylAb基因的插入对受体品种杂交结实率影响显著,而Xa21基因的插入对受体品种杂交结实率影响较小;转基因水稻品种(花粉供体)与非转基因水稻品种的杂交结实率变幅为0.056～0.13,在受体品种(花粉供体)与非转基因水稻品种的杂交结实率范围(0.052～0.417)之内.本研究花粉离体萌发和杂交结实结果表明转基因的插入对水稻品种异交潜力的影响甚微.     

60Co辐照对水稻基因组DNA诱变的分子生物学效应

以水稻品种农林8号及其⁶⁰Co γ射线辐照突变体农林8号m为研究材料,选用360个10碱基寡核苷酸随机引物,利用随机扩增多态性DNA标记技术筛选出1个引物OPG18在农林8号和农林8号m之间表现出共显性的多态性.通过对该共显性标记的克隆和序列分析表明,突变体农林8号m与农林8号相比有29 bp DNA片段的缺失.研究结果为⁶⁰Co γ射线辐照导致植物基因组DNA缺失提供了一个最直接明确的证据.     

荧光共振能量转移效率的实时定量测量

荧光共振能量转移（FRET）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用,与荧光显微镜结合,可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA和RNA的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展,FRET荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法,仅需使用一组滤光片和测量一个比值,利用供体和受体的发射谱肖除光谱间的串扰。该方法简单快速,可实时定量测量FRET的效率和供体与受体间的距离,尤其适用于基于GFP的供体－受体对。     

工程细菌大量生产淀粉酶

据英国专利报导,通过细菌供体劈开的DNA,继之与一种载体DNA片段结合,制备含有淀粉酶基因的重组DNA[注:载体指的是由质粒或λ噬菌体衍生物所组成]。所得含有重组DNA的无性系,可用作α-淀粉酶、β-淀粉酶或支链淀粉酶的生产。作者     

激光与DNA作用系统非线性共振实验初探

用紫外可见分光光度计,对受Ｈｅ－Ｎｅ激光辐照过的ＤＮＡ溶液进行扫描。发现２０９ｎｍ吸收峰降低了１０％,表明６３２．８ｎｍＨｅ－Ｎｅ激光波ＤＮＡ吸收而引起其构象变化。Ｈｅ－Ｎｅ激光波长６３２．８ｎｍ,约为２０９ｎｍ的３倍,恰好为我们理论研究的激光与ＤＮＡ相互作用非线性系统的超谐波共振波长。因此该实验结果使我们的理论结果得到了初步验证。     

梨自交不亲和基因cDNA芯片杂交条件优化及应用

[目的]优化梨自交不亲和基因(S-RNase或S基因)c DNA芯片杂交条件,利用芯片检测梨品种S基因型。[方法]提取梨品种雌蕊RNA,Cy3标记引物RT-PCR获得S基因荧光标记特异c DNA序列。设置不同杂交条件,用已知S基因型品种荧光标记的PCR产物在不同条件下分别与芯片杂交,杂交信号分析芯片杂交效果。用芯片优化杂交体系鉴定梨品种未知S基因型,DNA测序验证芯片鉴定结果。[结果]芯片杂交最佳条件:杂交温度42℃,杂交时间8~9 h,PCR纯化产物终浓度为200 ng·μl-1。优化杂交条件下芯片鉴定晚咸丰、秀水、丽江马占梨1、湘菊、木通梨、甘甜、弥渡小红梨、丽江大中古、金晶和弥渡火把等梨品种S基因型分别为:Pp S15Pp S52、Pp S4Pp S5、Pb S22Pp S37、Pp S1Pp S2、Pp S1Pp S3、Pp S13Pp S15、Pp S12Pb S42、Pb S21Pb S22、Pp S3Pp S60和Pp S5Pp S5。DNA测序验证各品种所含S基因与芯片鉴定结果一致。[结论]梨自交不亲和基因c DNA芯片优化杂交条件后可准确鉴定梨品种所含已鉴定的S基因资源。     

Nd:YAP激光辐照对雨生红球藻生理效应的荧光分析

目的：Nd：YAP激光辐照对雨生红球藻生理效应的荧光分析j方法：利用Nd：YAG激光（功率10W,辐照剂量为15s、35s、55s）辐照雨生红球藻,在对辐照细胞进行生长测定以及色素吸收光谱分析的基础上,进一步利用激光共聚焦扫描显微镜（LSCM）,在波长488nm的Ar^＋激发光条件下,对细胞的自体荧光以及吖啶橙染色的细胞核荧光物质进行定位定量分析,获得细胞自发荧光光谱和细胞核荧光物质的荧光光谱。结果：①低剂量的Nd：YAG激光辐照（15s左右）对藻细胞有促长作用,生长速率提高20．3％,色素吸收峰的峰值提高25．3％。较高剂量的Nd：YAG激光辐照（35s、55s）对藻细胞生长有抑制作用,并有明显的致死、致突效应。②对自体荧光的分析结果表明,与对照组相比,低剂量激光辐照组的细胞,在荧光光谱的峰型及峰值上变化不大,在682nm处均有较强的荧光发射,而高剂量激光辐照组的细胞多无明显的荧光发射。③对细胞核荧光物质的分析,雨生红球藻细胞在530nm（DNA）和640nm（RNA）处均有荧光发射峰。与对照组相比,低剂量激光辐照组的DNA荧光发射有所增强,但RNA的荧光发射则有所减弱;高剂量激光辐照组的核物质荧光发射谱,在峰型上与对照组存在差异,荧光强度也明显下降。结论：低剂量的Nd：YAP激光辐照对细胞核的DNA合成与复制有一定的刺激作用,可促进光合色素的合成并提高其对光能的吸收效率,从而增强光合活性,促进细胞的增殖与生长;高剂量激光辐照则对细胞的DNA有损伤作用,是致死率上升并发生突变的可能原因。     

梨自交不亲和基因cDNA芯片杂交条件优化及应用北大核心

[目的]优化梨自交不亲和基因(S-RNase或S基因)c DNA芯片杂交条件,利用芯片检测梨品种S基因型。[方法]提取梨品种雌蕊RNA,Cy3标记引物RT-PCR获得S基因荧光标记特异c DNA序列。设置不同杂交条件,用已知S基因型品种荧光标记的PCR产物在不同条件下分别与芯片杂交,杂交信号分析芯片杂交效果。用芯片优化杂交体系鉴定梨品种未知S基因型,DNA测序验证芯片鉴定结果。[结果]芯片杂交最佳条件:杂交温度42℃,杂交时间8~9 h,PCR纯化产物终浓度为200 ng·μl-1。优化杂交条件下芯片鉴定晚咸丰、秀水、丽江马占梨1、湘菊、木通梨、甘甜、弥渡小红梨、丽江大中古、金晶和弥渡火把等梨品种S基因型分别为:Pp S15Pp S52、Pp S4Pp S5、Pb S22Pp S37、Pp S1Pp S2、Pp S1Pp S3、Pp S13Pp S15、Pp S12Pb S42、Pb S21Pb S22、Pp S3Pp S60和Pp S5Pp S5。DNA测序验证各品种所含S基因与芯片鉴定结果一致。[结论]梨自交不亲和基因c DNA芯片优化杂交条件后可准确鉴定梨品种所含已鉴定的S基因资源。     

加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体构建与遗传转化北大核心

[目的]构建加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体,获得相应的转基因番茄植株。[方法]利用PCR技术从番茄c DNA文库中获得2 727 bp的加工番茄SlAGO4A基因。构建SlAGO4A基因的过量表达载体35S:SlAGO4A。以获得的SlAGO4A基因为模板,获得了SlAGO4A PIWI的220 bp的片段,构建SlAGO4A基因的RNAi干扰载体RNAi-PIWI,通过农杆菌介导的遗传转化,获得SlAGO4A过表达及干扰转基因番茄阳性植株,并利用实时荧光定量PCR(QRTPCR)技术检测过表达番茄阳性植株中的SlAGO4A基因的表达水平。[结果]经PCR鉴定获得5株独立转化的里格87-5干扰转基因加工番茄株系,获得6株独立转化的里格87-5过量表达转基因加工番茄株系,其6株SlAGO4A基因过表达的阳性植株的表达量均有不同程度的上调。[结论]为阐明SlAGO4A基因在加工番茄抗病毒信号通路中的功能奠定基础。     

加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体构建与遗传转化

[目的]构建加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体,获得相应的转基因番茄植株。[方法]利用PCR技术从番茄c DNA文库中获得2 727 bp的加工番茄SlAGO4A基因。构建SlAGO4A基因的过量表达载体35S:SlAGO4A。以获得的SlAGO4A基因为模板,获得了SlAGO4A PIWI的220 bp的片段,构建SlAGO4A基因的RNAi干扰载体RNAi-PIWI,通过农杆菌介导的遗传转化,获得SlAGO4A过表达及干扰转基因番茄阳性植株,并利用实时荧光定量PCR(QRTPCR)技术检测过表达番茄阳性植株中的SlAGO4A基因的表达水平。[结果]经PCR鉴定获得5株独立转化的里格87-5干扰转基因加工番茄株系,获得6株独立转化的里格87-5过量表达转基因加工番茄株系,其6株SlAGO4A基因过表达的阳性植株的表达量均有不同程度的上调。[结论]为阐明SlAGO4A基因在加工番茄抗病毒信号通路中的功能奠定基础。     

外源DNA导入燕麦后代的蛋白电泳及RAPD分析

将皮燕麦外源DNA通过花粉管途径导入裸燕麦受体品种,对获得的2个遗传性已经稳定的优良变异后代（品系）982D-2和982D-26进行了可溶性蛋白电泳和RAPD分析,结果表明：从可溶性蛋白电泳图谱中观察到982D-2后代具有3条供体亲本的特异蛋白带,其分子量分别为25.2KD,24KD和13KD;982D-26后代具有1条供体亲本的特异蛋白带。其分子量为24KD;选用37个引物对以上2个变异后代及其它们的供,受体亲本基因组DNA进行RAPD扩增,从其中D36和D522个引物的扩增图谱中观察到2个变异后代具有4个与供体亲本相同,而受体亲本所没有的特异性DNA片段。综合比较982D-2和982D-26变异后代的蛋白电泳及RAPD扩增图谱表明,它们在基因组水平上具有较大的遗传异质性,育种上可作为不同的新型种质资源加以利用。本研究的分析结果证明,供体皮燕麦外源DNA已通过花粉管途径导入到受体裸燕麦中。     

辐照外源DNA导入番茄的研究

利用＾６０Ｃｏ的γ射线辐照外源ＤＮＡ导入选育番茄。研究表明,辐照外源ＤＮＡ导入后,提高Ｄ０代的座果率;使Ｄ０代结籽数减少,但比没有辐照的ＤＮＡ导入要多,这些与剂量有一定的关系,差别明显。果脐有变化,这与短截花柱有关。在Ｄ１代的幼苗观察中,发现供体的叶形和幼苗茎杆颜色（紫色）的显性基因,已在受本中得到表达。     

花椰菜与黑芥非对称体细胞杂种的鉴定分析

选用兼具抗黑腐病、黑胫病、根肿病的野生种质黑芥(B.nigra)作为供体,具有良好原生质体培养能力的花椰菜(Boleracea var.botrytis L.)基因型"0307"作为受体,供体叶肉原生质体经不同剂量UV照射处理后,通过PEG介导,与不经任何处理的受体下胚轴原生质体融合,培养获得再生植株.形态学观察显示再生植株的表型多样,呈偏向受体花椰菜类型及中间类型分布:SRAP分子标记特征表明,杂种中受体的遗传信息较为完整,而来自供体的特异扩增带丢失量约为20.0%-97.8%,且不同杂种中存在热点丢失序列;约23.0%的再生植株其染色体数目小于供、受体染色体数之和;采用流式细胞仪对再生株的细胞DNA含量进行分析,结果显示,20%的植株其DNA含量小于供、受体DNA含量总和.对22棵再生植株进行了黑腐病人工接种抗性鉴定,17棵再生植株表现良好抗性,初步证明通过非对称体细胞杂交技术已将外源抗性基因转入花椰菜中.实验表明UV辐射处理,导致再生植株中供体遗传信息的部分丢失或者染色体在不同程度上的消减,获得了花椰菜与黑芥的非对称体细胞杂种,但UV的剂量效应不明显.     

水稻转基因系"明恢63-Xa21"的基因组分析

植物基因工程研究已经建立了多种转基因的方法 ,这些方法包括农杆菌侵染[1 ] 、粒子轰击[2 ] 、电激转化和原生质体培养[3 ] 等。研究人员希望通过这些方法 ,将功能外源基因整合到受体基因组 ,而同时不引起其它性状的变化。已有的研究表明 ,各种转基因系统均能成功地将外源基因整合到受体基因组并能稳定地遗传到后代[1～ 3 ] 。然而通常情况下人们主要关注目标性状的变化 ,而对受体基因组的其它变化研究较少。事实上许多转基因植物发生了不希望出现的变异[4,5] 。已建立的各种分子标记如ＳＳＲＰ(简单序列重复多态性 ) [6] 、ＲＡＰＤ(随机…