Der Biosyntheseweg der RNS-Ribose in Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16 und Pseudomonas facilis

Zusammenfassung Die am Fructose- und Gluconatabbau über den Entner-Doudoroff-Weg beteiligten Enzyme sowie die Enzyme des oxydativen Pentosephosphat-Weges wurden in Rohextrakten von Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16 und Pseudomonas facilis, sowohl nach autotrophem Wachstum als auch nach heterotrophem Wachstum auf Fructose oder Gluconat, bestimmt. Fructose induziert in H. eutropha alle Enzyme des Entner-Doudoroff-Weges, Gluconat nur die Gluconokinase, die 6-Phosphogluconat-Dehydratase und die 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat-Aldolase. Dagegen induzieren in P. facilis beide Substrate den gesamten Enzymsatz. Das Fehlen der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase in H. eutropha und das Vorhandensein einer NAD-abhängigen 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase in P. facilis wurden bestätigt. Die Enzymaktivitäten in voll induzierten, auf Fructose gewachsenen Zellen beider Arten sind ähnlich.Mit beiden Stämmen wurden Einbauexperimente mit U-¹⁴C-, 1-¹⁴C- und 6-¹⁴C-Fructose sowie 1-¹⁴C- und 6-¹⁴C-Gluconat als Substrate durchgeführt. Die Ribose wurde aus der RNS isoliert und durch Lactobacillus plantarum fermentativ in Essigund Milchsäure gespalten. Die spezifische Radioaktivität der einzelnen C-Atome wurde durch schrittweisen Abbau der Säuren, quantitative Bestimmung des dabei entstehenden ¹⁴CO₂ und Messung der darin enthaltenen absoluten Radioaktivität ermittelt.Die Ergebnisse zeigen, daß die Ribose in Stamm H 16 ausschließlich über die nicht-oxydativen Reaktionen des Pentosephosphat-Weges gebildet wird. Die C-Atome 1,2 und 3 des Gluconats tragen nicht signifikant zur Gluconeogenese bei.Das Markierungsmuster der Ribose aus P. facilis ist mit dem von Stamm H 16 nahezu identisch. Die oxydativen Reaktionen des Pentosephosphat-Weges über die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase sind von quantitativ geringerer Bedeutung als die Transaldolase-Transketolase-Reaktionen.

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The biosynthetic pathway of RNA ribose in Hydrogenomonas eutropha Strain H 16 and Pseudomonas facilis

Summary The enzymes involved in the degradation of fructose and gluconate via the Entner-Doudoroff-pathway as well as those involved in the oxidative pentose phosphate pathway have been determined in crude extracts of Hydrogenomonas eutropha strain H 16 and of Pseudomonas facilis after either autotrophic growth or heterotrophic growth on fructose or gluconate as substrates. In H. eutropha fructose induces all enzymes of the Entner-Doudoroff-pathway, gluconate induces only glucokinase, 6-phosphogluconate dehydratase and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase. In contrast, in P. facilis both substrates induce the entire set of enzymes. The absence of 6-phosphogluconate dehydrogenase in H. eutropha and the presence of a NAD-linked 6-phosphogluconate dehydrogenase in P. facilis have been confirmed. Otherwise, the enzyme activities in fully induced fructose grown cells of both species are similar.Incorporation experiments were performed using both bacterial species and employing U-¹⁴C-, 1-¹⁴C-, and 6-¹⁴C-fructose as well as 1-¹⁴C- and 6-¹⁴C-gluconate as substrates. Ribose was isolated from RNA and fermented by Lactobacillus plantarum with the production of acetic and lactic acids. By stepwise degradation of the acids and by quantitative measurement and scintillation counting of the carbon dioxide formed the specific radioactivity of each carbon atom has been determined.The results demonstrate that in strain H 16 ribose is formed exclusively via the non-oxidative reactions of the pentose phosphate pathway. Carbon atoms 1 to 3 of gluconate do not significantly contribute to gluconeogenesis.With P. facilis an almost identical labelling pattern was observed, indicating that the oxidative reactions of the pentose phosphate pathway via 6-phosphogluconate dehydrogenase are quantitatively of minor importance for ribose synthesis than the transaldolase-transketolase reactions.

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Abkürzungen ATP Adenosin-5-triphosphat - DAP Dihydroxyacetonphosphat - E-4-P Erythrose-4-phosphat - ED Entner-Doudoroff - EDTA Äthylen-diamin-tetraessigsäure - FDP(ase) Fructose-1,6-diphosphat(ase) - F-6-P Fructose-6-phosphat - G-6-P(-DH) Glucose-6-phosphat(-Dehydrogenase) - GAP Glycerinaldehyd-3-phosphat - GDH Glycerin-1-phosphat-Dehydrogenase - GK Gluconokinase - HK Hexokinase - KDPG 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat - LDH Lactat-Dehydrogenase - NAD(H₂) Nicotin-amid-adenin-dinucleotid (reduziert) - NADP(H₂) Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (reduziert) - PGI Phosphoglucose-Isomerase - PP Pentosephosphat - 6-PG(-DH) 6-Phosphogluconat(-Dehydrogenase) - 6-PG-DHT 6-Phosphogluconat-Dehydratase - R-5-P Ribose-5-phosphat - Ru-5-P Ribulose-5-phosphat - Su-7-P Seduheptulose-7-phosphat - TA Transaldolase - TEA Triäthanolaminhydrochlorid - TIM Triosephosphat-Isomerase - TK Transketolase - TPP Thiaminpyrophosphat - Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan - Xu-5-P Xylulose-5-phosphat     

Die Aktivität von Phosphoglucose-Isomerase und Phosphoglucomutase während der Morphogenese kernhaltiger und kernloser Acetabularien

Summary The activity of two enzymes of the UDP-glucose and UDP-galactose biosynthetic pathway—phosphoglucose-isomerase and phosphoglucomutase—have been followed during morphogenesis of the unicellular green alga Acetabularia mediterranea. We have found that the increase in enzyme activities during morphogenesis represents de novo synthesis. The kinetic constants (K _m, K _i) of phosphoglucose-isomerase are similar to those found for the enzyme from rabbit muscle; mannose-6-phosphate was found to be a competitive inhibitor.The increase in activity of phosphoglucose-isomerase parallels the linear increase in total protein, neither showing changes with cap formation. In contrast, the activity of phosphoglucomutase is enhanced markedly when cap formation starts.Whether the nucleus is present or absent does not affect the above mentioned properties of the two enzymes. From this fact we conclude that the enzyme syntheses are regulated by the cytoplasm, probably at the level of translation. Contributions of DNA from chloroplasts and mitochondria can be excluded because in anucleate cells, which have an already established gradient of m-RNA, actinomycin D (10 g/ml) has no effect on the synthesis of these enzymes.There are also differences in the spatial distribution of the two enzymes. We were able to show that both enzymes are synthesized unequally in different regions of the cells.

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Abkürzungen PGI Phosphoglucose-isomerase - PGM Phosphoglucomutase - UDPG-Pyr UDPG-Pyrophosphorylase - G-6-PDH Glucose-6-phosphat Dehydrogenase - G-6-P Glucose-6-phosphat - F-6-P Fructose-6-phosphat - G-1-P Glucose-1-phosphat - UDPG Uridin-diphosphat-glucose - G-1,6-diP Glucose-1,6-diphosphat - 6-PG 6-Phosphogluconat - TRAP Triäthanolamin-Puffer - K _m Michaelis-Konstante - K _p veränderte K _m - K _i Inhibitor-Konstante     

Chitinsynthese bei dem Flußkrebs Orconectes limosus: Aktivität der Phosphoglucosamin-isomerase und Einbau von Glucose-U-14C in Chitin

Zusammenfassung Im Zusammenhang mit der Chitinsynthese wurde die Phosphoglucosamin-isomerase in den Organen des Flußkrebses Orconectes limosus untersucht. In Integumentgewebe, Kiemen und Enddarm lagen die Aktivitäten bei Tieren unmittelbar nach der Häutung hochsignifikant höher als bei Zwischenhäutungstieren.Der zeitliche Ablauf folgender Parameter wurde über einen Häutungszyklus hinweg bestimmt: Aktivität der Phosphoglucosamin-isomerase im Integumentgewebe, Einbaurate markierter Glucose in Chitin sowie das Chitingewicht. Der Kurvenverlauf zeigte unerwartete Phasendifferenzen. Die Phosphoglucosaminisomerase scheint ein die Chitinsynthese steuerndes Schlüsselenzym zu sein. Obgleich sich die Isomeraseaktivität zwischen den D₁- und D₂-Stadien verdoppelt, wird die Hämolymphglucose nicht zur Chitinsynthese herangezogen; ihr Einbau in Chitin erfolgt erst unmittelbar nach der Häutung.Die extrem hohen Einbauraten von Glucose in Chitin sprechen dafür, daß Kohlenhydrate als Energiequelle zumindest zu dieser Zeit keine große Rolle spielen; diese Aufgabe fällt wahrscheinlich den Lipiden zu.

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Chitin synthesis in the crayfish, Orconectes limosus: activity of glucosaminephosphate isomerase and incorporation of glucose-U-¹⁴C

Summary In connection with our studies of chitin synthesis the activity of glucosaminephosphate isomerase was determined in the organs of the crayfish, Orconectes limosus. The activities in integumentary tissues, gills and intestine were greater with a high significance for animals directly after molt than for intermolt animals.Within the molt cycle the time courses of the following parameters were determined: glucosaminephosphate isomerase activity in integumentary tissue, incorporation of glucose-U-¹⁴C into chitin and chitin weight. Unexpectedly these curves show significant phase-differences. Glucosaminephosphate isomerase seems to be a key enzyme regulating the chitin synthesis. But although the isomerase activity doubles between stages D₁ and D₂, hemolymph glucose is not used for chitin synthesis at this time. The incorporation of hemolymph glucose into chitin starts immediately after the molt.The extremely high rate of incorporation of glucose into chitin seems to demonstrate that carbohydrates are not very important as an energy source at least at that time. Most likely lipids are the energy source.

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Verwendete Abkürzungen AG-6-P N-Acetylglucosamin-6-phosphat - F-6-P D-Fructose-6-phosphat - G-6-P D-Glucosamin-6-phosphat - PGI Phosphoglucosamin-isomerase. Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.     

Regulation of pyruvate kinase from Propionibacterium shermanii

Pyruvate kinase from Propionibacterium shermanii was shown to be activated by glucose-6-phosphate (G-6-P) at non-saturating phosphoenol pyruvate (PEP) concentrations but other glycolytic and hexose monophosphate pathway intermediates and AMP were without effect. Half-maximal activation was obtained at 1 mM G-6-P. The presence of G-6-P decreased both the PEP_0.5V and ADP_0.5V values and the slope of the Hill plots for both substrates. The enzyme was strongly inhibited by ATP and inorganic phosphate (P_i) at all PEP concentrations. At non-saturating (0.5 mM) PEP, half-maximal inhibition was obtained at 1.8 mM ATP or 1.4 mM P_i. The inhibition by both P_i and ATP was largely overcome by 4 mM G-6-P. The specific activity of pyruvate kinase was considerably higher in lactate-, glucose- and glycerol-grown cultures than that of the enzyme catalysing the reverse reaction, pyruvate, phosphate dikinase. It is suggested that the activity of pyruvate kinase in vivo is determined by the balance between activators and inhibitors such that it is inhibited during gluconeogenesis while, during glycolysis, the inhibition is relieved by G-6-P.Abbreviations PEP phosphoenolpyruvate - G-6-P glucose-6-phosphate - P_i inorganic phosphate     

Characterization of cytosolic phosphoglucoisomerase from immature wheat (Triticum aestivum L.) endosperm

Phosphoglucoisomerase from cytosol of immature wheat endosperm was purified 650-fold by ammonium sulphate fractionation, isopropyl alcohol precipitation, DEAE-cellulose chromatography and gel filtration through Sepharose CL-6B. The enzyme, with a molecular weight of about 130,000, exhibited maximum activity at pH 8.1. It showed typical hyperbolic kinetics with both fructose 6-P and glucose 6-P withK _m of 0.18 mM and 0.44mM respectively. On either side of the optimum pH, the enzyme had lower affinity for the substrates. Using glucose 6-P as the substrate, the equilibrium was reached at 27% fructose 6-P and 73% glucose 6-P with an equilibrium constant of 2.7. The ΔF calculated from the apparent equilibrium constant was +597 cal mol^-1. The activation energy calculated from the Arrhenius plot was 5500 cal mol^-1. The enzyme was completely inhibited by ribose 5-P, ribulose 5-P and 6-phosphogluconate, withK _i values of 0.17, 0.25 and 0.14 mM respectively. The probable role of the enzyme in starch biosynthesis is discussed.     

Untersuchungen über das Transportsystem für Thiamin bei Bacillus cereus

Zusammenfassung Bei dem untersuchten Transportsystem für Thiamin bei Bacillus cereus wechseln rhythmisch 1–2 h andauernde Aufnahme-und Abgabephasen miteinander ab. Diese großen Phasen sind in kleinere von durchschnittlich 45 s Dauer unterteilt. Die Geschwindigkeit der Thiaminaufnahme wird von pH-Wert, Temperatur, Alter der Zellen, Energie-und Nährstoffversorgung sowie Thiaminkonzentration des Mediums beeinflußt. Sie folgt der Michaelis-Menten-Kinetik: K _m =1,98x10^-8 M; V _max=1,19x10^-6 mol/g TGxmin. Gefördert wird die Aufnahmerate durch K⁺, Ca²⁺ und Mg²⁺, gehemmt wird sie durch Pyrithiamin, EDTA, H⁺-Ionen, Wasserstoffacceptoren und-donatoren; OH^--Ionen bewirken eine Umkehr der Transportrichtung. Als erklärende Theorie wird eine Kopplung der Thiaminpermeation mit Protonenverschiebungen in der Membran diskutiert.

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Studies on the thiamine transport system in Bacillus cereus

The thiamine transport system in Bacillus cereus exhibits rhythmical changes of resorption-and excretion-phases lasting 1–2 h. These main phases are subdivided in shorter ones with an average duration of 45 s. The velocity of the thiamine uptake is influenced by pH, temperature, age of cells, energy and substrate supply and thiamine concentration of the medium. The Michaelis-Menten-Kinetic can be used to describe the uptake: K _m =1.98x10^-8 M; V _max=1.19x10^-6 mol/g dry weightxmin. The rate is enhanced by K⁺, Ca²⁺ and Mg²⁺, and inhibited by Pyrithiamin, EDTA, H⁺-ions, proton donors and proton acceptors; OH^--ions cause a change in the direction of transport. A theoretical explanation can be given by assuming a coupling of the thiamine permeation with proton movements in the membrane.

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Liste der Abkürzungen AMP Adenosinmonophosphat - ADP Adenosindiphosphat - ATP Adenosintriphosphat - DNP Dinitrophenol - EDTA Athylendiamintetraessigsäure - FAD Flavinadenindinucleotid - NAD Nicotinamidadenindinucleotid - NADP Nicotinamidadenindinucleotidphosphat - TPP Thiaminpyrophosphat     

Pyruvate,orthophosphate dikinase from Acetobacter aceti

A pyruvate, orthophosphate dikinase (EC 2.7.9.1) has been isolated from Acetobacter aceti grown on pyruvate as the only source of carbon and energy. The enzyme was purified 65-fold, and its molecular weight was determined to be about 330,000 by gel filtration.The optimum pH was 8.0 in the forward direction [phosphoenolpyruvate (PEP) formation] and 7.1 for the backward reaction (pyruvate production). In both directions Mg²⁺ was required (forward K _m 1.70 mM; reverse K _m 0.87 mM) and no other divalent cation was able to replace it. The K _m values for pyruvate, ATP, and P_i were 27 M, 0.20 mM, and 0.83 mM, respectively, in the forward direction. The K _m values for PEP, AMP, and PP_i were 0.13 mM, 6 M, and 62 M, respectively, for the reverse reaction. The substrate-product pairs pyruvate-PEP, ATP-AMP, P_i-PP_i were competitive inhibitors to each other in both directions. These product inhibition studies suggest for the enzyme from A. aceti nonclassical three-site Tri (Uni Uni) Ping-Pong kinetics.Abbreviations PEP phosphoenolpyruvate - OAA oxaloacetate - MW molecular weight - SDS sodium dodecyl sulphate - TEMG buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, 1 mM glutathione     

Zur Regulation des aeroben Intermediärstoffwechsels in ausgehungerten Hefezellen bei Zugabe von Glucose und NH4 +-Ionen

Summary When glucose is added to starved yeast cells under strictly aerobic conditions ([O₂]>90% air saturation) the concentrations of G-6-P, F-6-P, FDP, pyruvate, malate and -ketoglutarate rise, whereas those of PEP and PGA fall to a low level. This indicates that PK is activated and either GAPDH or PGK becomes rate limiting. Exogenous citrate is metabolized only after feeding. The level of pyruvate, -ketoglutarate and malate accumulated is lower if ammonia was added to the medium, which indicates the onset of amino acid synthesis. The concentrations of adenosine and uridine nucleotides are diminished if ammonia is present in addition to glucose. Actinomycin prevents the decrease in adenosine nucleotide concentrations.The accumulation of FDP and pyruvate after glucose addition is more pronounced in the presence of ammonia. This, together with changing rates of ethanol accumulation, indicates that PDC is a limiting factor during starvation and becomes activated very slowly, especially in the presence of ammonia.

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Abkürzungen ADH Alkoholdehydrogenase (1.1.1.1) - Ala L-(+)-Alanin - AMP, ADP, ATP Adenosin-mono-, di-, triphosphat - Asp L-(+)-Asparaginsäure - Asp-NH₂ L-(+)-Asparagin - DAP Dihydroxyacetonphosphat - EtOH Äthanol - F-6-P -D-Fructose-6-Phosphat - FDP D-Fructose-1,6-diphosphat - GAP D-Glycerinaldehyd-3-phosphat - GAPDH Glycerinaldehydphosphat-dehydrogenase (1.2.1.12) - G-6-P D-Glucose-6-phosphat - Glu L-(+) Glutaminsäure - Glu-NH₂ Glutamin - -Kg -Ketoglutarsäure - MDH Malatdehydrogenase (1.1.1.37) - NADH Diphospho-pyridin-nucleotid, reduziert - PDC Pyruvatdecarboxylase (4.1.1.1) - PEP Phosphoenolpyruvat - PFK Phosphofructokinase (2.7.1.11) - PGK Phosphoglyceratkinase (2.7.2.3) - 3-PGS, PGA D-3-Phosphoglycerinsäure - 1,3-PGS D-1,3-Diphosphoglycerinsäure - PK Pyruvatkinase (2.7.1.40) - Pyr Pyruvat - Ser L-Serin - Thr L-(-)-Threonin - TRA Triäthanolamin - UMP Uridin-5-monophosphat - UDP Uridin-5-diphosphat - UTP Uridin-5-triphosphat Unter Benutzung der Dissertation von S. M. Mizani Änderungen der Metabolitkonzentrationen in ausgehungerten Hefezellen (Saccharomyces carlsbergensis) bei Zugabe von Glucose und NH₄ ⁺-Ionen unter streng aeroben Bedingungen, Bonn 1972.     

Die Differenzierung isolierter Herzzellen in einem chemisch definierten Nährmedium

Zusammenfassung Aus Fragmenten von Herzkammern und Vorhöfen von Hühnerembryonen 11 Tage inkubierter Eier wurden Zellen mit Trypsin isoliert und in vitro kultiviert. Bei Anwendung neuer Techniken ist die Autorhythmizität der Herzzellen unter standardisierten Kultivierungsbedingungen in dem chemisch definierten Nährmedium SM 20 mit 1,3 mM K⁺ länger als 30 Tage und im SM 20 mit 5,1 mM K⁺ nur für 4–11 Tage aufrechtzuerhalten.Im SM 20 mit 1,3 mM K⁺ existiert in der ersten Hälfte der Kultivierungszeit eine signifikante Differenz zwischen der Pulsationsrate der Atrium- und Ventrikelzellen. Die Pulsationsrate der Atriumzellen verändert sich während der Kultivierung in ähnlicher Weise wie die Herzfrequenz in der Ontogenese. Die Pulsationsrate im SM 20 mit 1,3 mM K⁺ ist nach dem 1. bzw. 2. Tage signifikant höher als im SM 20 mit 5,1 mM K⁺.Im SM 20 haben sich nach 16–20 Tagen typische Myofibrillen mit Z-Streifen und I- und A-Bändern gebildet.Für die Erhaltung der Automatie der Zellschichten, zur funktionellen Differenzierung und Myogenese sind weder extrazelluläre Fettsäuren und Lipide noch Serumproteine notwendig. Auch Versuche einer Adaptation der Zellen oder einer Kultivierung in konditionierten Nährmedien erübrigen sich hierfür.Fragen der Funktion und Struktur in Verbindung mit dem extrazellulären in vitro-Milieu werden diskutiert.Die Erhaltung organspezifischer Merkmale in einem synthetischen Nährmedium eröffnet neue Möglichkeiten einer quantitativen Muskelzellkultur.

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The differentiation of heart cells in a chemically defined medium

Summary Single cells were isolated with the aid of trypsin from fragments of ventricles and atria of embryonic chicks of 11 days of incubation and were cultivated in vitro. By the use of new techniques the autorhythmicity of the heart cells can be maintained under standardized conditions of cultivation in the chemically defined medium SM 20, containing 1.3 mM K⁺, for more than 30 days and in the SM 20 containing 5.1 mM K⁺, for only 4 to 11 days.During the first half of the cultivation period in the SM 20 containing 1.3 mM K⁺ there is a significant difference between the rate of pulsation of the atrial cells and the ventricle cells. In the course of cultivation the rate of pulsation of the atrial cells changes in a manner similar to that of the heart during ontogenesis. After the first or the second day the rate of pulsation in the 1.3 mM K⁺-containing SM 20 is significantly higher than the rate in the SM 20 containing 5.1 mM K⁺.In the heart cells cultivated in the SM 20 for 16 to 20 days typical myofibrils are formed with Z, I and A bands.Neither extracellular fatty acids and lipids nor serum proteins are required by the cell layers for the maintenance of automaticity, for functional differentiation, and for myogenesis. Adaptation of the cells or cultivation in conditioned media is likewise unnecessary for differentiation.Problems of function and structure in connection with the extracellular environment in vitro are discussed.The maintenance of organ-specific characteristics in a synthetic medium opens new possibilities for a quantitative muscle cell culture.

     

Catabolism of d-fructose and d-ribose by Pseudomonas doudoroffii

1. The 1-P-fructokinase (1-PFK) and 6-P-fructokinase (6-PFK) from Pseudomonas doudoroffii were partially purified by a combination of (NH₄)₂SO₄ fractionation and DEAE-Sephadex column chromatography. The pH optima of these enzymes were 9.0 and 8.5, respectively.
2. When the concentrations of the substrates of the 1-PFK reaction were varied, Michaelis-Menten kinetics were observed. The Kms for d-fructose-1-P (F-1-P) and ATP were 3.03×10^-4 M and 3.39×10^-4 M, respectively. Variation of MgCl₂ at fixed concentrations of F-1-P and ATP resulted in sigmoidal kinetics; about 10 mM MgCl₂ was necessary for maximal activity. Activity of 1-PFK was inhibited when the ratio of ATP: Mg⁺⁺ was higher than 0.5, suggesting that ATP: 2Mg⁺⁺ was the substrate and that free ATP was inhibitory. Although an absolute requirement for K⁺ or NH ₊ ⁴ could not be demonstrated, these cations stimulated the rate of the reaction. Activity of 1-PFK was not significantly affected by 3 mM AMP, cyclic-AMP, P_i, d-fructose-6-P (F-6-P), ADP, P-enolpyruvate (PEP), pyruvate, citrate, or l-glutamate.
3. Sigmoidal kinetics were observed for 6-PFK when the concentration of F-6-P was increased and the level of ATP was kept constant. Activity of 6-PFK was increased by ADP, inhibited by PEP, and unaffected by 3 mM AMP, cyclic-AMP, P_i, F-1-P, pyruvate, or citrate.

     

Eigenschaften der NAD-spezifischen Hydrogenase aus Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Aus zellfreiem Extrakt von Hydrogenomonas H 16 wurde die lösliche Hydrogenase 45 fach bis zu einer spezifischen Aktivität von 36500 E/g Protein angereichert. Das Enzym katalysiert die Reduktion von NAD mit molekularem Wasserstoff. Ein Cofaktorbedürfnis konnte nicht festgestellt werden. Der Einfluß von NADH, ATP, Bicarbonat und Magnesium auf die hydrogenasekatalysierte NAD-Reduktion war unerheblich. Das angereicherte Enzym ist flavin- und pyridinnucleotidfrei und reagiert mit NAD, nicht mit O₂, NADP, FMN, FAD oder Methylenblau. Die drei letztgenannten Wasserstoff-Acceptoren werden lediglich in Gegenwart katalytischer Mengen NAD reduziert. Die lag-Phase der Reduktion von NAD läßt sich durch Vorinkubation des Enzyms mit NADH oder Wasserstoff, nicht jedoch mit NAD eliminieren. Die Hemmung der Hydrogenasereaktion durch Sauerstoff ist gering. Reduzierende Agenzien wie Mercaptoäthanol oder Sulfid setzten die Reaktionsrate herab.Die Michaeliskonstante der löslichen Hydrogenase für molekularen Wasserstoff beträgt K _m ^H2 =1,9·10^–4 M. Die NAD-Konzentration, bei der halbmaximale Aktivität erreicht wird, beträgt [NAD]_{0,5 (V)}=1,3·10^–4 M. Das pH-Optimum wird in 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer bei pH 8,5 und in 0,05 M Tris-HCl-Puffer bei pH 7,9 erreicht. Unter den angegebenen Bedingungen lag das Temperatur-Optimum bei 36°C. Die Aktivierungsenergie der löslichen Hydrogenase wurde als 10,4 kcal/mol ermittelt.

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Properties of the NAD-Specific Hydrogenase from Hydrogenomonas H 16

Summary A soluble hydrogenase from cell-free extracts of Hydrogenomonas H 16 has been purified 45-fold up to a specific activity of 36,500 units per g protein. The enzyme catalyzes the reduction of NAD with molecular hydrogen. It does not require cofactors. The NAD-reduction catalyzed by this enzyme is influenced to only a small extent by the presence of NADH, ATP, bicarbonate or magnesium ions. The enzyme is free from flavins and pyridine nucleotides, reacts only with NAD and not with oxygen, NADP, FMN, FAD or methylene blue. FMN, FAD and methylene blue are reduced only in the presence of catalytic amounts of NAD. The lag-phase of the reduction of NAD can be eliminated by preincubating the enzyme in the presence of NADH or molecular hydrogen; NAD is ineffective. The inhibition of the hydrogenase reaction by oxygen is negligible. Reducing agents such as mercaptoethanol or sulfide decreased the reaction rate.The Michaelis constant of the soluble hydrogenase for molecular hydrogen is K _m ^H2 =1.9·10^–4 M. Half maximal activity is attained at a NAD-concentration of [NAD]_{0.5 (V)}=1.3·10^–4 M. The pH-optimum is 8.5 in 0.05 M potassium phosphate buffer and 7.9 in 0.05 M Tris-HCl-buffer; reaction rates were maximal at 36°C under the conditions employed. The activation energy was calculated to be 10.4 kcal/mol.

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Abkürzungen E Enzymeinheit (mole Substrat/min) - E _x Extinktionsänderung bei der Wellenlänge x nm - Ext._x Extinktion bei der Wellenlänge x nm - KP Kaliumphosphat (KH₂PO₄-K₂HPO₄-Gemisch) - MB Methylenblau - NAD Nicotinamid-adenin-dinucleotid - NADH reduziertes - NAD; TEAE Triäthylaminoäthyl - Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan     

Properties of phosphoenolpyruvate carboxylase in desalted extracts from isolated guard-cell protoplasts

Properties of phosphoenolpyruvate (PEP) carboxylase (EC 4.1.1.31) obtained from isolated guard-cell protoplasts of Vicia faba L. were determined following rapidly desalting of the extract on a Sephadex G 25 column. The activity of PEP carboxylase was measured as a function of PEP and malate concentration, pH and K⁺ concentration within 2–3 min after homogenization of the guard-cell protoplasts. The activity of this enzyme was stimulated by PEP concentrations of 0.1 to 0.75 mM and by K⁺ ions (12 mM), but inhibited by PEP concentrations above 1 mM and by malate. Changes in the K_m(PEP) and V_max values with increasing malate concentrations (2.5 and 5 mM) indicate that the malate level, varying in relation to the physiological state of guard cells, plays an important role in regulating the properties of phosphoenolpyruvate carboxylase.Abbreviations CAM Crassulacean acid metabolism - GCP guard-cell protoplast - PEP phosphoenolpyruvate Dedicated to Professor Dr. Hubert Ziegler on the occasion of his 60th birthday     

Polymorphism of erythrocyte phosphoglucomutase,adenylate kinase and adenosine deaminase in northern Thailand

Summary Phenotypes of the erythrocyte enzymes phosphoglucomutase (PGM) (n-587), adenylate kinase (AK) (n=695), and adenosine deaminase (ADA) (n=616) were determined by horizontal starch gel electrophoresis in Thai subjects from norther Thailand, mainly from the provinces of Chiang Mai and Lamphun. The following gene frequencies were calculated: PGM ₁ ¹ 0.7385 PGM ₁ ² 0.2487 PGM ₁ ⁶ 0.0102 PGM ₁ ⁷ 0.0026, AK ¹ 0.9950 AK ² 0.0050, ADA ¹ 0.9180 ADA ² 0.0820.The regular, apparently autosomal transmission of the PGM ₁ ⁶ and PGM ₁ ⁷ alleles was demonstrated in 7 families revealing sufficient data.

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Zusammenfassung Die Phänotypen der Erythrocytenenzyme Phosphoglucomutase (PGM) (n=587), Adenylatkinase (AK) (n=695), and Adenosindeaminase (ADA) (n=616) wurden mittles horizontaler Stärkegelelektrophorese bei Thailändern aus Nordthailand, hauptsächlich aus den Provinzen Chiang Mai und Lamphun, bestimmt. Auf Grund der Ergebnisse wurden die in der englischen Zusammenfassung angegebenen Genfrequenzen berechnet. Die regelmäßige, anschinend autosomale Vererbung der Allele PGM ₁ ⁶ und PGM ₁ ⁷ wurde in 7 Familien mit ausreichenden Daten nachgewiesen.

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Established and supported by Stiftung Volkswagenwerk.     

Grammaspektrometrische und flammenphotometrische Untersuchungen über Kaliumgehalt und Kaliumverteilung im Menschen

Zusammenfassung Bei gesunden Normalpersonen wurde gammaspektrometrisch über die Gamma-Emission des im natürlichen Kalium enthaltenen Isotops K⁴⁰ der Gesamtkörper kaliumgehalt gemessen. Der Mittelwert von GK_K betrug bei Männern 1,68 gK/kg, bei Frauen 1,51 gK/kg mit einer Schwankungsbreite ± 15% (n=92).Die flammenphotometrisch gemessene Kaliumkonzentration im Plasma von Normalpersonen war 4,03 mäq/l±0,26, die gleichzeitig gemessene Kaliumkonzentration im Erythrozytensediment 90,9 mäq/l Sediment±2,6 (n=57).Bei gesunden Versuchspersonen wurden die drei genannten Kaliumparameter gleichzeitig gemessen und die Veränderung dieser Größen bei der durch ein Saluretikum verursachten experimentellen Kaliumverarmung verfolgt. Während einer Versuchsperiode von 7 Tagen nahm der Gesamtkörperkaliumgehalt bei Einnahme vonChlorthalidon (2×100 mg/Tag) im Mittel um 7,7%, die Kaliumkonzentration in Plasma bzw. Erythrozyten um 27,5% bzw. 3,1% ab.Erythrozyten stellen unter den hier gewählten Versuchsbedingungen ein Zellsystem dar, das qualitativ Änderungen der Kaliumkonzentration des intrazellulären Raumes anzeigt. Das Ausmaß des Kaliumverlustes ist jedoch bei anderen Zellsystemen größer, wie sich aufgrund der Bestimmung des Gesamtkörperkaliumgehaltes nachweisen läßt. Die Bedeutung der Bestimmung verschiedener Kaliumparameter beim Menschen für die klinische Beurteilung pathologischer Zustände wird diskutiert.In der Arbeit verwandte Abkürzungen GK_K Gesamtkörper-Kalium-Gehalt, P_k bzw - E_k Kalium-Konzentration des Plasmas bzw. des Erythrozytensediments - K_i/K_e Quotient aus intrazellulärer und extrazellulärer K-Konzentration - K^nat natürlich vorkommendesK-Isotopengemisch - U_k×V Kalium-Ausscheidung im Urin/24 Std - Hk Hämatokrit Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. Dr. h. c. Dr. h. c. Dr. h. c. B.Rajewsky zum 70. Geburtstag gewidmet.Mit Unterstützung des Bundesministeriums für Wissenschaftliche Forschung und des Bundesministeriums des Innern.Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.Frau A.Schulze und Frl. B.Zimmermann danken wir für zuverlässige technische Assistenz.     

Phosphoenolpyruvate carboxylase from Acetobacter aceti

In Acetobacter aceti growing on pyruvate as the only source of carbon and energy, oxaloacetate (OAA) is produced by a phosphoenolpyruvate (PEP) carboxylase (EC 4.1.1.31). The enzyme was purified 122-fold and a molecular weight of about 380,000 was estimated by gel filtration.The optimum pH was 7.5 and the K _m values for PEP and NaHCO₃ were 0.49 mM and about 3 mM, respectively. The enzyme needed a divalent cation; the K _m for Mn²⁺, Co²⁺ and Mg²⁺ were 0.12, 0.26 and 0.77 mM, respectively. Maximal activity was only obtained with Mg²⁺. Mn²⁺ and Co²⁺ became inhibitory at high concentrations.The activity was inhibited by succinate and, to a lesser extent, by fumarate, citrate, -ketoglutarate, aspartate and glutamate.As compared with the corresponding enzyme from A. xylinum, the PEP carboxylase of A. aceti showed the following differences: a) It had an absolute requirement for acetyl CoA (K _a 0.18 mM) or propionyl CoA (K _a 0.2 mM). b) It was not affected by ADP. c) It was sensitive to thiol blocking agents.Abbreviations PEP phosphoenolpyruvate - OAA oxaloacetate - MW molecular weight - TEMG buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, 1 mM glutathione - HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid     

Der Sauerstoffverbrauch des Facettenauges von Calliphora erythrocephala in Abhängigkeit von der Temperatur und dem Ionenmilieu

Zusammenfassung Es wird der Sauerstoffverbrauch der Retinula der Schmeißfliege (Mutante chalky) in Abhängigkeit von Lichtintensität und Temperatur sowie vom Ionenmilieu bestimmt.Die Atmungsmessungen wurden mit einem weiterentwickelten Mikrorespirometer nach Prop durchgeführt. Das neue Gerät wird ausführlich beschrieben.Der Sauerstoffverbrauch der Augen (auf Frischgewicht bezogen) ist bei Männchen und Weibchen gleich. Die Atmung steigt (bei 25° C) von 3,9 ml O₂/g × Std im Dunkeln auf maximal 8,9 ml O₂/g × Std bei Belichtung an.Die Höhe des Sauerstoffverbrauchs ist abhängig vom Alter der Imagines. Während der ersten Tage nimmt die Atmung schnell zu und nähert sich dann langsamer im Laufe der 2. Woche einem Höchstwert.Im Temperaturbereich 15–40° C wurden für den Dunkelstoffwechsel und den maximalen Hellstoffwechsel gleiche Q ₁₀- und -Werte ermittelt (Q ₁₀ 1,95, 12000 cal/Mol).Der Sauerstoffverbrauch in Abhängigkeit vom log₁₀ der Lichtintensität aufgetragen ergibt steile S-förmige Kurven, die mit steigender Versuchstemperatur zu höheren Lichtintensitäten parallel verschoben werden.Bei Erhöhung der K⁺-Ionenkonzentration sinkt der Dunkelstoffwechsel, während der maximale Hellstoffwechsel nicht beeinflußt wird. Mit steigender Kaliumkonzentration verlagern sich die S-Kurven (Sauerstoffverbrauch in Abhängigkeit vom log₁₀ der Intensität) nach rechts, mit steigender Natriumkonzentration nach links.Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.Mit Unterstützung der Alexander von Humboldt-Stiftung.     

Eine NADP(H)-spezifische Oxidoreduktase beiCalliphora

Zusammenfassung BeiCalliphora erythrocephala Meig. wird eine NADP(H)-abhängige Oxidoreduktase nachgewiesen, die Glukose-6-phosphat und Sorbit-6-phosphat umsetzt. Das Enzym wird durch Sorbit-6-phosphat ebenso wie durch Sorbit inaktiviert. Die mit Glukose-6-phosphat erzielte maximale Aktivität ist wenig geringer als die für die Sorbitdehydrogenase ermittelte Größe. Die Einschleusung der Fruktose in den Kohlenhydratstoffwechsel könnte, zumindest zu einem Teil, über Sorbit-6-phosphat zu Glukose-6-phosphat und weiter zu Glykogen oder Trehalose erfolgen.

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A NADP(H)-specific oxidoreductase inCalliphora

Summary InCalliphora erythrocephala Meig. a NADP(H)-dependent oxidoreductase transforms glucose-6-phosphate and sorbit-6-phosphate. The enzyme is inactivated by sorbit-6-phosphate as well as sorbit. The maximum activity achieved using glucose-6-phosphate as a substrate is slightly less than that reported for sorbitdehydrogenase withCalliphora (Wenzl, 1966). The introduction of fructose into carbohydrate metabolism could, at least in part, follow the sorbit-6-phosphate in glucose-6-phosphate and further to glycogen or trehalose.

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Teil einer Diplomarbeit, die unter Leitung von Herrn Prof. Dr. Langer durchgeführt wurde.     

Bildung flüchtiger Säuren bei der Vergärung von Pyruvat und Fructose in anaerober Dunkelkultur von Rhodospirillum rubrum

Zusammenfassung R. rubrum bildet anaerob im Dunkeln aus exogenen und endogenen Substraten hauptsächlich Acetat und Propionat.In Kulturen mit Pyruvat als Substrat wurde in der Regel mehr Acetat als Propionat gebildet (4:1–1:1), mit Fructose dagegen weniger Acetat (1:2–1:3). Ruhende Zellen produzierten aus Pyruvat, im Vergleich zu Kulturen mit (NH₄)₂SO₄ im Medium, relativ mehr Propionat als Acetat.Beim Abbau von gespeicherter PHBS wurde relativ mehr Acetat und weniger Propionat als beim Abbau endogener Polysaccharide produziert.Eine Zugabe von Ascorbat (0,8 u. 1,6%) oder K₃[Fe(CN)₆] (0,08 u 0,32%) hatte nur einen geringen Effekt auf das Verhältnis von Acetat zu Propionat. Exogenes CO₂ war, besonders bei Zugabe von Fructose als Substrat, für die Synthese von Propionat notwendig. Die Wege der Acetat- und Propionatbildung unter anaeroben Bedingungen im Dunkeln werden diskutiert.

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The synthesis of volatile acids by fermentation of pyruvate and fructose in anaerobic dark cultures of Rhodospirillum rubrum

Summary Under anaerobic conditions in the dark R. rubrum produced mainly acetate and propionate from exogenous and endogenous substrates.With pyruvate as a substrate usually less propionate than acetate was synthesized, with fructose, however, more propionate than acetate was produced.In resting cells, compared with cultures having (NH₄)₂SO₄ in the medium, more propionate than acetate was synthesized from pyruvate.By degradation of stored poly--hydroxybutyric acid under anaerobic dark conditions relatively more acetate is produced than by degradation of endogenous polysaccharide.Addition of ascorbate (0.8 and 1.6%) or K₃[Fe(CN)₆] (0.08 and 0.32%) had little influence on the relative concentrations of acetate and propionate.Exogenous CO₂ was necessary for the synthesis of propionate, especially when fructose was the substrate. The pathways of acetate and propionate production anaerobically in the dark are discussed.

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Abkürzungen BChl Bacteriochlorophyll - PEP Phosphoenolpyruvat - PHBS Poly--hydroxybuttersäure - I.p.m. Impulse (¹⁴C) pro Minute     

Regulation of basolateral membrane potential after stimulation of Na+ transport in proximal tubules

Summary We have previously shown that stimulation of apical Na-coupled glucose and alanine transport produces a transient depolarization of basolateral membrane potential (V _bl) in rabbit proximal convoluted tubule (PCT. Sl segment). The present study is aimed at understanding the origin of the membrane repolarization following the intial effect of addition of luminal cotransported solutes. Luminal addition of 10–15mMl-alanine produced a rapid and highly significant depolarization ofV _bl (20.3±1.1 mV,n=15) which was transient and associated with an increase in the fractional K⁺ conductance of the basolateral membrane (t _K) from 8 to 29% (P<0.01,n=6). Despite the significant increase int _K, the repolarization was only slightly reduced by the presence of basolateral Ba²⁺ (2mM,n=6) or quinine (0.5 mM,n=5). The repolarization was greatly reduced in the presence of 0.1 mM 4-acetamino-4isothiocyamostilbene-2,2-disulfonic acid (SITS) and blunted by bicarbonate-free solutions. Intracellular pH (pH _i ) determined with the fluorescent dye 2, 7-bis-2-carboxyethyl-5(and-6)-carboxyfluorescein (BCECF), averaged 7.39±0.02 in control solution (n=9) and increased to 7.50±0.03 in the first 15 sec after the luminal application of alanine. This was followed by a significant acidification averaging 0.16±0.01 pH unit in the next 3 min. In conclusion, we believe that, contrary to other leaky epithelia, rabbit PCT can regulate its basolateral membrane potential not only through an increase in K⁺ conductance but also through a cellular acidification reducing the basolateral HCO ₃ ^– exit through the electrogenic Na-3(HCO₃) cotransport mechanism.     

K+ channels of stomatal guard cells: Abscisic-acid-evoked control of the outward rectifier mediated by cytoplasmic pH

The activation by abscisic acid (ABA) of current through outward-rectifying K⁺ channels and its dependence on cytoplasmic pH (pH_i) was examined in stomatal guard cells of Vicia faba L. Intact guard cells were impaled with multibarrelled and H⁺-selective microelectrodes to record membrane potentials and pH_i during exposures to ABA and the weak acid butyrate. Potassium channel currents were monitored under voltage clamp and, in some experiments, guard cells were loaded with pH buffers by iontophoresis to suppress changes in pH_i. Following impalements, stable pH_i values ranged between 7.53 and 7.81 (7.67±0.04, n = 17). On adding 20 M ABA, pH_i rose over periods of 5–8 min to values 0.27±0.03 pH units above the pH_i before ABA addition, and declined slowly thereafter. Concurrent voltage-clamp measurements showed a parallel rise in the outward-rectifying K⁺ channel current (I_{K, out}) and, once evoked, both pH_i and I_{K, out} responses were unaffected by ABA washout. Acid loads, imposed with external butyrate, abolished the ABA-evoked rise in I_{K, out}. Butyrate concentrations of 10 and 30 mM (pH₀ 6.1) caused pH_i to fall to values near 7.0 and below, both before and after adding ABA, consistent with a cytoplasmic buffer capacity of 128±12 mM per pH unit (n = 10) near neutrality. Butyrate washout was characterised by an appreciable alkaline overshoot in pH_i and concomitant swell in the steady-state conductance of I_{K, out}. The rise in pH_i and i_{K, out} in ABA were also virtually eliminated when guard cells were first loaded with pH buffers to raise the cytoplasmic buffer capacity four- to sixfold; however, buffer loading was without appreciable effect on the ABA-evoked inactivation of a second, inward-rectifying class of K⁺ channels (I_{K, in}). The pH_i dependence of I_{K, out} was consistent with a cooperative binding of at least 2H⁺ (apparent pK_a = 8.3) to achieve a voltage-independent block of the channel. These results establish a causal link previously implicated between cytoplasmic alkalinisation and the activation of I_{K, out} in ABA and, thus, affirm a role for H⁺ in signalling and transport control in plants distinct from its function as a substrate in H⁺-coupled transport. Additional evidence implicates a coordinate control of I_{K, in} by cytoplasmic-free [Ca²⁺] and pH_i.Abbreviations ABA abscisic acid - [Ca²⁺]_i cytoplasmic free [Ca²⁺]_i - E_K K⁺ equilibrium potential - I_{K, out}, I_{K, in} outward-, inward-rectifying K⁺ channel (current) - I-V current-voltage (relation) - Mes 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid - pH_i cytoplasmic pH - Tes 2-{[2-hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]-amino}ethanesulfonic acid - V_m membrane potential We are grateful to G. Thiel (Pflanzenphysiologisches Institut, Universität Göttingen, Germany) for helpful discussions. This work was possible with equipment grants-in-aid from the Gatsby Charitable Foundation, the Royal Society and the University of London Central Research Fund. F.A. holds a Sainsbury Studentship.