白眉蝮蛇蛇毒神经生长因子的研究Ⅰ.神经生长因子(NGF)的纯化及其生物学活性鉴定

研究白眉蝮蛇蛇毒神经生长因子纯化方法并行生物学活性鉴定。方法从白眉蝮蛇乌苏里亚种蛇毒中,经硫酸胺分段盐析,提取含有神经生长因子的粗制品,再经二乙氨基乙基纤维素离子交换层析和羧甲基纤维素离子交换层析,分离出蛋白质纯品,经十二烷基磺酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定,结果纯化的纯品为单一区带,分子量为４３ｋｕ。生物学活性鉴定证明分离出的该蛋白质纯品可促进神经细胞突起密集生长。     

墨旱莲对4种蝮蛇毒引起的炎症和出血的影响

目的探讨墨旱莲提取液对短尾蝮蛇毒、蛇岛蝮蛇毒、白眉蝮蛇毒及尖吻蝮蛇毒所致的炎症和出血的影响。方法应用短尾蝮蛇毒、蛇岛蝮蛇毒、白眉蝮蛇毒及尖吻蝮蛇毒所致大鼠足跖肿胀的致炎模型,观察墨旱莲提取液对蛇毒所致大鼠足跖肿胀的影响。墨旱莲提取液分别与不同蛇毒混合,给小鼠腹部皮下注射,观察其对蛇毒引起的小鼠皮下出血的影响。结果墨旱莲提取液15g／kg连续2次灌胃给药,对短尾蝮蛇毒、蛇岛蝮蛇毒、白眉蝮蛇毒或尖吻蝮蛇毒所致大鼠足跖肿胀的急性炎症造模和短尾蝮蛇毒棉球肉芽肿的慢性炎症造模(20g／kg)均有明显的抑制作用,对这些蛇毒引起的小鼠皮下出血也能明显抑制。结论墨旱莲提取液对短尾蝮蛇毒、蛇岛蝮蛇毒、白眉蝮蛇毒及尖吻蝮蛇毒引起的炎症和出血均有明显的抑制作用。     

东北白眉蝮蛇毒类凝血酶的分离纯化

我国多年来因技术原因 ,一直使用多组份混合成分的蛇毒制剂 ,临床上虽有一定疗效 ,但存在严重的副作用。作者利用细胞融合技术成功地建立了一株高表达类凝血酶抗体的细胞系 ,该抗体经纯化后 ,可高效亲和白眉蝮蛇类凝血酶。该技术使纯化蛇毒类凝血酶工艺有了很大的飞跃 ,也使蛇毒制品质量达到世界先进水平。方法 :采用天然蛇毒经 DEAE-琼脂糖凝胶层析 ,收集活性组份 ,再经葡聚糖凝胶 G- 75柱层析后 ,收集活性组份 ,最后经类凝血酶亲和柱层析 ,测定 2 80 nm的光吸收度 ,收集蛋白峰 ,测定活性 ,获得了单一组份的类凝血酶 ,即为纯化的类凝血酶…     

蛇毒纤溶酶的分离纯化-单克隆技术的成功应用

目的从蛇毒中纯化具有溶栓功效的纤溶酶.方法用DEAE-Sephadex A50离子交换,单抗亲和层析两步柱层析方法,对白眉蝮蛇蛇毒进行纯化,得到了一种纤溶酶活性组分.结果分离出的纤溶酶没有出血毒及神经毒等毒性,是一种安全的溶栓药物.结论运用单克隆技术的亲和层析能成功分离纤溶酶.     

蛇毒纤溶酶的神经生长因子活性

目的证明蛇毒生长因子具有神经生长因子活性,并初步探讨其原因.方法分实验组和对照组,定量和定性测定两组的神经生长因子活性,对比蛇毒纤溶酶和神经生长因子的氨基酸序列.结果蛇毒纤溶酶在20U/ml时具有明显的神经生长因子活性,N-末端氨基酸序列与神经生长因子同源性达80～90%.结论蛇毒纤溶酶具有明显的神经生长因子活性,其结构与神经生长因子相似.     

长白山白眉蝮蛇乌苏里亚种类凝血酶（TLE）基因克隆及分析

目的为了获得长白山白眉蝮蛇乌苏里亚种类凝血酶基因。方法根据GeneBank自眉类凝血酶eDNA5．和3保守序列设计了引物,通过RT-PCR从白眉蝮蛇乌苏里亚种毒腺TotalRNA中扩增得到1条长714bp的特异cDNA片段,将该cDNA片段重组到SimpleTvector,转化进E．coliJM109competentcell,阳性克隆委托生物公司测序,利用生物信息学方法对测序结果进行分析。结果该特异性片段与蛇毒类凝血酶同源性为95％,它为一个开发阅读框架,其编码的蛋白质序列与其他蛇毒类凝血酶序列同源性为94％,与其他蛇毒类凝血亲缘关系非常近。结论本实验获得了一种新型白眉蝮蛇乌苏里亚种类凝血酶基因。     

清栓酶（蝮蛇抗栓酶）的药理研究与临床应用进展

清栓酶（蝮蛇抗栓酶）的药理研究与临床应用进展中国蛇协蛇毒研究所邓禄延,覃公平,胡征林自本世纪八十年代起,蛇毒抗凝制剂在我国研制及应用于临床以来,相继有尖吻蝮蛇毒制剂去纤酶,长白山陆生白眉蝮蛇毒制剂清栓酶（蝮蛇抗栓酶）及江浙蝮蛇毒制剂江浙蝮蛇毒抗栓酶（...     

广西眼镜蛇毒神经生长因子分离纯化方法

为了得到更高纯度和活性的广西眼镜蛇毒神经生长因子(never growth factor,NGF),我们对原有的分离纯化方法进行改进。采用DEAE CL-6B离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S离子交换柱结合的方法进行分离。在分离纯化过程中,采用PC12细胞检验每一步所得结果中的NGF活性,并测定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度。经DEAE CL-6B离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S离子交换柱分离纯化后,得到的第二峰具有NGF活性,并且已达到电泳纯。经PC12细胞验证后,确定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度为0.1μg/m L。     

紫外线^60Co照射对蛇毒毒性的影响

选择体重20g 左右小白鼠分别使用眼镜蛇毒、蝮蛇毒以及经过紫外线、~(60)Co 照射灭菌后的这两种蛇毒进行半数致死量的测定,结果经紫外线照射后的眼镜蛇毒和白眉蝮蛇毒的毒性降低了6.98%和6.41%.经~(60)Co 照射的眼镜蛇毒和蝮蛇毒的毒性降低了21%和33%.     

几种蛇毒抑菌作用的比较

本文通过平板扩散实验观察了蛇岛蝮蛇毒、长白山白眉蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒及中华眼镜蛇毒对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌作用。结果表明四种蛇毒对试验菌株均有不同程度的抑菌作用;其中白眉蝮蛇毒对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为０．６３ｍｇ／ｍｌ,对大肠杆菌为５．０ｍｇ／ｍｌ。抑菌作用与蛇毒中Ｌ—氨基酸氧化酶的活力有相关性。利用ＣＭ—ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５ＳｅｐｈｄｅｘＧ—７５一对江浙蝮蛇毒的抑菌成份进行初步的柱层析分离,从纯化的各组份看,Ｌ—氨基酸氧化酶活力高的其抑菌活性也高。     

国产三种类凝治疗副反应的回顾性对比

国产三种类凝治疗副反应的回顾性对比沈阳军区大连第二疗养院汤爱丽,刘秀芬,庞军钧近二十年来,我国对蛇毒的生化、药理、提纯有了长足的进展。目前国内蛇毒酶制剂以抗凝溶栓为主,主要含三个体系,即以东北白眉蝮蛇毒为原料生产的蝮蛇抗栓酶（Ｅｌｉｍｉｎａｔｅ－ｅｍ...     

舟山眼镜蛇毒神经生长因子的亲和层析分离

用层析和制备SDS-PAGE法纯化舟山眼镜蛇(Najanajaatra Cantor)毒神经生长因子(NGF),免疫家兔获得抗血清。用辛酸-硫酸铵沉淀法初步纯化IgG,蛋白A-Sepharose亲和层析进一步纯化IgG,并与CNBr活化的Sepharose4B偶联,采用亲和层析法对舟山眼镜蛇毒神经生长因子进行分离纯化。产物经过SDS-PAGE检测呈一条带,并显示了良好的生物学活性。纯化NGF最大比活性为5.0×104U/mg蛋白,亲和常数为4.35×108L/mol,亲和层析分离NGF得率比传统分离方法得率提高35.2%,该方法为NGF的大量提取提供了技术支持。     

谈清栓酶与东北白眉蝮蛇毒市场

近几年来,在防治各种心、脑、周围闭塞性血管病过程中,清栓酶(蝮蛇抗栓酶)显示出良好疗效,市场需求量较大。从而自86年起,生产厂家逐渐增多,目前国内已有32个厂家或单位生产此类药品。随着厂家增多,其原料东北白眉蝮蛇毒(粗原毒)也相应的畅销,售价高于江浙蝮蛇毒8～10倍。由于蛇毒差价原因,给某些商贩造成可乘之机,将江浙蝮蛇毒冒充东北白眉蝮蛇毒进行兕售。据了解不少厂家或单位直接以个体养蛇户或商贩手中购买粗原毒,造成原料不纯,直接影响清栓酶药品质量。江浙蝮蛇毒以外观上与东北白眉蝮蛇毒相似,但含神经毒、出血毒素均较高,一般分离制药残留较多,临床用药容易出现其反应,并且降低血小板作用明显。而东北白眉蝮蛇毒含神经毒极微,出血毒素极低,经一般分离制药即可以除去,临床用药安全,一般不降低血小板。根据调查分析,假冒原料有以下几个原因:     

乌梢蛇血清对白眉蝮等3种蛇毒解毒作用初探

目的 探讨乌梢蛇血清对孟加拉眼镜蛇、白眉蝮、莽山烙铁头3种毒蛇的解毒作用。方法 给18～22g昆明小鼠分别注射盂加拉眼镜蛇毒、白眉蝮蛇毒及莽山烙铁头蛇毒后,随机分组注射不同浓度的乌梢蛇血清,并观察对3种蛇毒的解毒效果。结果 发现（1）乌梢蛇血清对盂加拉眼镜蛇毒有解毒作用．且注射蛇毒与4ml／kg的血清混合液的解毒作用最好,但随着间隔时间的延长,解毒作用逐渐减弱;（2）乌梢蛇血清对白眉蝮蛇毒有解毒作用,且注射量为1ml／kg和2ml／kg时出现了拮抗作用;（3）乌梢蛇血清对莽山烙铁头蛇毒有解毒作用,但莽山烙铁头蛇毒对血清注射量和间隔时间不敏感,在血清注射量为2ml／kg时和注射蛇毒10min后,再注射4ml／kg的血清时出现了拮抗作用。（4）只给小鼠注射不同量的乌梢蛇血清,发现乌梢蛇血清对小鼠无明显的毒副作用。结论 乌梢蛇血清对3种蛇毒均有解毒作用。     

长白山白眉蝮蛇蛇毒酸性PLA_2质谱鉴定及其对血小板聚集的抑制作用

通过对纯化得到的长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2（ABUSV-PLA2）进行胶内胰蛋白酶酶解,产生的肽段经高效液相色谱-电喷雾串联质谱（HPLC-nESI-MS/MS）进行序列测定,蛋白鉴定采用SequestBioworks软件完成。ABUSV-PLA2与其它蛇毒来源PLA2的氨基酸序列比对表明：ABUSV-PLA2是一种新的蛇毒酸性磷脂酶A2。以ADP诱导的人血小板聚集实验结果表明：ABUSV-PLA2对ADP诱导的血小板聚集有轻微的解凝效应,但具有显著拮抗血小板的聚集作用,并呈现明显的剂量-效应关系,IC50为356nmol/L。     

蛇毒类凝血酶的基因工程研究进展

自 1 936年 Klobusitzki和 Konig首次从美洲矛头蝮蛇 ( Bothrops jararaca)毒中获得部分纯化的类凝血酶以来 ,迄今已发现 30多种蛇毒中含有类凝血酶组份 ,并有 2 0多种先后得到分离和纯化。尤其近年来基于有关蛇毒类凝血酶分子结构及酶学性质的研究成果 ,部分蛇毒类凝血酶已经作为治疗药物而广泛应用于临床 ,如国外的 Ancrod和Batroxobin蛇毒抗凝剂 ,国内的五步蛇毒去纤酶、东北白眉蝮蛇抗栓酶 (清栓酶 )、江浙蝮蛇抗栓酶等已广泛用于临床治疗脑血栓形成、脉管炎、冠心病、心肌梗死 ,也有用于治疗癌痛综合症 [1]。但目前有关蛇毒类凝血酶…     

蛇毒神经生长因子促进周围神经再生的诱发电位观察

目的：研究蛇毒神经生长因子（sNGF)对大鼠坐骨神经损伤后诱发电位的影响,评价蛇毒神经生长因子在促进周围神经再生中的作用。方法：建立大鼠坐骨神经钳夹模型,局部滴加药物和术后肌注sNGF,通过脊髓诱发电位（SEP）,运动诱发电位（MEP）评定,观察坐骨神经修复情况。结果：sNGF治疗后可使伤后SEP,MEP提早出现,结论：蛇毒提取的NGF对大鼠坐骨神经损伤修复具有促进作用。     

间接ELISA法在注射用矛头蝮蛇血凝酶蛇毒种属鉴别中的应用

目的建立间接ELISA法定性检测矛头蝮蛇血凝酶,用于巴曲亭蛇毒种属来源检测。方法将矛头蝮蛇血凝酶为抗原免疫小鼠,与尖吻蝮蛇血凝酶、白眉蝮蛇血凝酶交叉筛选获得特异性单克隆抗体。优化矛头蝮蛇血凝酶单抗(一抗)、HRP标记的羊抗鼠(二抗)IgG、矛头蝮蛇血凝酶(抗原)工作浓度,建立间接ELISA检测方法。考察方法的重复性、中间精密度,确定方法的适用性。采用膜超滤法将巴曲亭中辅料去除,按照建立的ELISA法检测,判定种属来源。结果矛头蝮蛇血凝酶单抗具有强特异性,一抗的最佳工作浓度1∶4000(250ng),二抗的最佳工作浓度1∶4000(250ng),抗原浓度2μg/孔,该法重复性和中间精密度较好。巴曲亭与矛头蝮蛇血凝酶单抗有特异性反应,与其它蛇毒来源血凝酶单抗无交叉反应,确定巴曲亭来源于矛头蝮蛇蛇毒。结论本研究建立的ELISA法具有较好的特异性,可作为巴曲亭蛇毒种属来源判断的方法。     

江浙蝮蛇蛇毒纤溶酶的纯化

目的：从江浙蝮蛇蛇毒中纯化出无出血毒的纤溶酶。方法：经DEAE-SepharoseFF离子交换树脂和Superdex75PG凝胶过滤树脂,从江浙蝮蛇蛇毒中纯化出2种可直接溶解纤维蛋白的蛋白酶：F1,F2。结果：它们20μg皮下注射小鼠都无出血反应,F1,F2SDS-PAGE电泳纯度在95%以上。结论：纯化的两个纤溶酶为进一步基础研究和临床应用奠定了基础。     

两步柱色谱法纯化 CHO 表达的重组人β神经生长因子（β-rhNGF）

基因重组技术生产蛋白药物较传统提取生产方式具有诸多优点。本文运用一步离子交换色谱层析（Sepharose Fast Flow）和反相(C4)色谱层析串联纯化了CHO 工程细胞株分泌表达的重组人β 神经生长因子（β-rhNGF）,纯化产物经SDS-PAGE及反相HPLC 分析纯度均达到 95% 以上,生物学活性经 PC12 细胞和鸡胚背根神经节测定均与 Sigma 标准品无差异。产物经两步纯化后的收率达70% 以上,为建立该产品切实可行的工业化纯化工艺提供了依据。