重组人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

按照人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因成熟肽编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出360bp的片段,插入到改构载体pTIG-trx上,获得了pTIG-trx—BDNF原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因成熟肽编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并对表达产物进行了分离纯化,得到纯度大于83％的样品,Western杂交证实该蛋白具有hBDNF抗原活性。     

戊型肝炎病毒多拷贝重组质粒的构建及在毕赤酵母中的表达

目的体外构建戊型肝炎病毒(HEV)ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,以提高HEVORF2128-660在毕赤酵母中的表达水平。方法采用PCR技术扩增目的基因ORF2128-660(E),然后将ORF2128-660(E)同义点突变为ORF2128-660,构建重组表达质粒ORF212 8-660/p AO815(单拷贝),Bam HⅠ和BglⅡ双酶切获得的目的基因表达盒(AOX-ORF2128-660)插入去磷酸化的质粒ORF2128-660/p AO815,得到2(AOX-ORF2128-660)/p AO815(2拷贝)质粒。重复上述方法依次构建3(AOX-ORF2128-660)/p AO815(3拷贝)、4(AOX-ORF2128-660)/p AO815(4拷贝)等多拷贝重组质粒。得到的多拷贝重组质粒电转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析比较不同拷贝数转化子的表达产量,ELISA检测表达产物的生物活性。结果构建了戊型肝炎病毒(HEV)ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,表达的目的蛋白相对分子质量约为59 000,4拷贝重组质粒表达水平高于其他拷贝数重组质粒表达水平。结论成功构建了HEVORF2128-660多拷贝表达质粒,提高了其在毕赤酵母中的表达水平。     

mNUDC基因在巴斯德毕赤酵母中表达载体的构建及表达

目的:探索小鼠核迁移蛋白C(mNUDC)在毕赤酵母分泌表达的方法.方法:应用PCR扩增本实验室所构建的重组质粒PET28b-his-mNUDC中的mNUDC基因,使用基因重组方法构建毕赤酵母真核表达栽体pPICZaA-his-mNUDC,电击转化酵母茵株KM71后,经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定上清中重组mNUDC蛋白表达量.结果:经过PCR方法,有效扩增了mNUDC基因,构建了pPICZα A-his-mNUDC酵母表达质粒,序列分析表明所构建的含mNUDC基因的质粒与设计相同,mNUDC蛋白得到正确表达.使用SDS-PAGE和Western blot方法可以检测到mNUDC的稳定、高效地分泌表达.结论:成功地构建了mNUDC基因的毕赤酵母表达载体pPICZα A-his-mNUDC,并在毕赤酵母中实现分泌型离表达,为进一步研究mNUDC蛋白对小鼠的生物活性奠定了实验基础.     

人脑源性神经营养因子基因表达

用聚合酶链式反应(PCR)从人基因组DNA中扩增了人脑源性神经营养因子(hBDNF) cDNA和hBDNF成熟蛋白编码片段,分别克隆到pUC18中.经测序确认两个插入片段序列正确.hBDNF cDNA在CMV启动子控制下在NIH/3T3细胞中表达,用RT-PCR检测转染细胞确有BDNF mRNA存在.BDNF成熟蛋白编码序列在T7启动子控制下在E.coli中表达,SDS-PAGE表明,BDNF得到表达,以包涵体形式存在.     

人三叶因子1大肠杆菌及毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的:构建人三叶因子1(hTFF1)的大肠杆菌及毕赤酵母表达载体。方法:从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF1 cDNA,用PCR方法扩增hTFF1基因,并将其分别克隆到大肠杆菌的表达载体pET32α及毕赤酵母的表达载体pCAPZαA中,构建原核及真核重组表达质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1。结果:通过双酶切和基因序列分析确定插入pET32α和pGAPZαA中的片段为hTFF1基因片段。结论:重组质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1成功构建,为在比较原核和真核细胞中hTFF1高效表达的情况及下一步的功能研究奠定了基础。     

一种新型巴斯德毕赤酵母表达载体的构建及甘露聚糖酶的表达

目的:构建以带自身启动子的蔗糖转化酶基因(suc2)为选择标记的载体,用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法:根据已发表的蔗糖转化酶基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以啤酒酵母INVSC1总DNA为模板,扩增出包含自身启动子和终止区序列的suc2基因。将该基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了以suc2为选择标记的表达载体pPIC12K。将甘露聚糖酶基因man克隆入载体pPIC12K,用PEG/LiCl法转化毕赤酵母GS115菌株。以蔗糖为惟一碳源筛选转化子,利用底物平板检测筛选到的转化子中man基因的表达,并对重组表达菌株进行连续传代实验。结果:部分转化子周围产生明显的水解圈,证明甘露聚糖酶已经得到分泌表达;对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的遗传稳定性。结论:以带自身启动子的suc2基因为选择标记的表达载体构建成功,并且这个新型表达载体能够对外源基因进行稳定有效的分泌表达。     

蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

AX15是一种比天然睫状神经营养因子具有更高的生物学活性、更好的稳定性和可溶性的hCNTF突变体。在巴斯德毕赤酵母中表达时AX15易发生降解。氨基酸序列分析表明降解位于由12和13位氨基酸残基组成的双碱性氨基酸之后。根据KEX2蛋白酶的底物专一性把双碱性氨基酸从RR变为RK,构建了KEX2抗性的AX15突变体AX15（R13K）。AX15（R13K）的稳定性得到了显著的提高,在诱导100 h后也未发生降解。利用超滤浓缩和凝胶过滤得到了纯度>90%的AX15（R13K）。TF-1细胞存活实验表明AX15（R13K）具有与AX15相同的生物学活性。蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体可能具有更好的体内稳定性,在临床应用上具有潜在的优势。     

高比活人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

人睫状神经营养因子(hCNTF)及其突变体有望成为治疗肥胖症的新型药物。为了减少hCNTF的副反应,提高其疗效,在hCNTF四重突变体AX15 (R13K)的基础上引入S16 5D Q16 6H突变,构建了高比活的DH_AX15 (R13K)突变体。体外和体内实验表明DH_AX15 (R13K)的活性约是AX15 (R13K)的5倍。同时体内实验还发现DH_AX15(R13K)的作用比AX15 (R13K)更为持久。这种更为持久的作用可能是由于活性提高而非半衰期延长引起的。高比活的hCNTF突变体一方面可以在保证疗效的前提下减少蛋白用量,减少副反应;另一方面可以在不增加副反应的前提下增加最大耐受剂量,提高疗效,在临床应用上具有潜在的优势     

苦瓜MAP30基因的毕赤酵母表达载体构建及重组菌株的筛选

目的:从苦瓜中克隆MAP30全长基因,并将该基因连接至表达载体pPIC9中,建立酵母菌落PCR筛选方法。方法采用改良SDS法从苦瓜表皮中提取基因组DNA,设计特异性的引物,通过PCR技术扩增出全长861bp的MAP30基因。该基因经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接至毕赤酵母表达载体pPIC9中。重组载体转化GS115菌株,运用菌落PCR鉴定重组菌株。结果:基因测序表明,该基因已成功插入酵母表达载体pPIC9α-factor分泌信号下游,同源性分析表明该基因与GeneBank(AF284811)的核苷酸同源性达99.9%,氨基酸同源性达100%。菌落PCR显示外源基因已整合入酵母GS115菌株中。结论:成功地克隆了MAP30全长基因,并构建了含MAP30基因的重组毕赤酵母表达载体,并获得了整合菌株,为下一步研究奠定了基础。     

玉米赤霉烯酮降解酶毕赤酵母表达载体的构建及其表达

目的构建毕赤酵母表达载体pPIC9-ZEN-jjm,筛选高效分泌表达活性目的蛋白的菌株。方法克隆ZEN-jjm基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切连接至pPIC9中,电转化至毕赤酵母GS115。利用RDB培养基和甲醇诱导表达进行筛选。HPLC检测表达蛋白降解玉米赤霉烯酮的活性。结果测序表明ZEN-jjm成功插入pPIC9中,SDS-PAGE表明获得1株高效表达目的蛋白的重组酵母,其分子量约29 kDa。HPLC表明其能有效地降解玉米赤霉烯酮。结论玉米赤霉烯酮降解酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。     

一种增加重组毕赤酵母拷贝数提高胰岛素前体产量的策略

[目的] 为了进一步提高毕赤酵母表达生产人胰岛素前体的产量,[方法] 将构建的表达载体pPICZα-IP 电转至毕赤酵母X-33中,在100 μg/mL zeocin的YPDS抗性平板筛选获得过量表达人源胰岛素前体(IP)的重组菌株B4和S6.在此基础上,以过量表达胰岛素前体的B4和S6为出发菌株,以SacI线性化的表达载体pPICZα-IP进行重复电转化,并在1000 μg/mL zeocin的YPDS平板上筛选获得一株拷贝数为7的重组毕赤酵母2B4.[结果] 该菌株在5L规模发酵罐上,人源胰岛素前体产量是低拷贝数菌株B7的2.7倍,且菌体并未因拷贝数高而表现出生长不良的现象.实时定量PCR检测后,发现2B4菌株胰岛素前体基因的转录水平是B7的2倍.[结论] 综上结果表明,采用抗性筛选和重复电转相结合的高拷贝重组毕赤酵母构建策略,能有效促进目的基因的转录水平,最终显著提高目标蛋白的产量.     

High-level expression and characterization of a novel serine protease in Pichia pastoris by multi-copy integration

A novel serine protease from Trichoderma koningii (SPTK) was synthesized and expressed in Pichia pastoris. The recombinant SPTK was completely inhibited by phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), suggesting that SPTK belonged to the subgroup of serine proteases. The optimum pH and temperature for the recombinant SPTK reaction were 6.0 and 55 °C, respectively. SPTK performed a tolerance to most organic solvents and metal ions, and the addition of Triton X-100 exhibited an activation of SPTK up to 243% of its initial activity but SDS strongly inhibited. Moreover, our study showed that a portion of SPTK was N-glycosylated during fermentation. The activity and thermal stability of the recombinant SPTK were improved after the removal of glycosylation, and the N-glycosylation of SPTK could be efficiently removed through co-culture with P. pastoris strains expressing Endo-β-N-acetylglucosaminidase H. We constructed expression vectors harboring from one to four repeats of Sptk-expressing cassettes via an in vitro BioBrick assembly approach. And the result of quantitative polymerase chain reaction (qPCR) indicated that the tandem expression cassettes were integrated into the genome of P. pastoris through a single recombination event. These strains were used to study the correlation between the gene copy number and the expression level of SPTK. The results of qPCR and enzyme activity assays indicated that the copy number variation of Sptk gene generally had a positive effect on the expression level of SPTK, while an increase in integration of target gene did not guarantee its high expression. The maximum yield and specific activity of SPTK in P. pastoris were obtained from the recombinant yeast strain harboring two-copy tandem Sptk-expressing cassettes, the yield reached 0.48 g/l after a 6-d induction using menthol in shake flasks and 3.2 g/l in high-density fermentation with specific activity of 5200 U/mg. In addition, the recombinant SPTK could efficiently degrade chicken feather and hydrolyzed the gelatin layer of photographic film. These properties made the recombinant SPTK a suitable candidate for industrial applications and for eliminating the pollution of keratin.     

重组人kallistatin蛋白在毕赤酵母中的高效表达及生物活性分析

为了研究kallistatin(Kal)的生物活性,本实验构建了可分泌表达Kal的毕赤酵母菌株。首先通过PCR方法从pAAV-Kal中扩增出KalcDNA,并克隆至酵母表达载体pPIC9,得到甲醇酵母分泌型表达载体pPIC9-Kal,然后将载体线性化并电击转化毕赤酵母GS115(his4),通过MD平板筛选出阳性表达菌株。阳性表达菌株在BMMY培养基(pH7.0)中29℃培养,经2%甲醇诱导表达96h,摇瓶表达量可达14mg/L。表达上清经PhenylSuperose、Heparin SepharoseFF分离纯化,目的蛋白纯度达到98%,分子量为58kDa。生物活性实验显示,所得到的Kal蛋白具有较好的抗氧化活性,过氧化物酶活性达到(163±4)U/(mg·min),可有效降低H2O2对LX-2细胞的氧化损伤。另外,重组产生的Kal还能抑制HUVEC细胞的增殖。本研究首次成功地利用毕赤酵母表达系统分泌表达了有生物活性的Kal,为继续开展其抗肿瘤活性奠定了基础。     

蚓激酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)体内的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增含自身信号肽的蚓激酶基因F238,将其克隆到pUCm-T载体上,并进行测序。GenBank登录号为:DQ202401。测序结果表明基因全长为738bp,共编码245个氨基酸,包括7个氨基酸的信号肽序列和238个氨基酸的成熟肽序列。与粉正蚓(Lumbricus rubellus)F-III-2相比,核苷酸与氨基酸序列的同源性均为99%,仅存在2个碱基的差异,导致2个氨基酸的突变。通过生物信息学方法对蛋白质的理化及结构特性进行分析预测,F238的等电点为4.61,含有11个半胱氨酸,形成3个二硫键。蛋白质分子主要由β折叠组成,具有丝氨酸活性中心,属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类。以重组质粒pUCm-T-F238为模板,通过PCR方法扩增去信号肽的蚓激酶基因F238-m,构建毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9-F238-m,将其线性化后用电穿孔法导入酵母宿主菌GS115中。在MM和MD平板上筛选表型,经甲醇诱导后,SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量为28kDa左右,纤维平板法测定活力最高可达100U/mL。     

玉米大斑病菌STK1与EGFP融合基因载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

STK1基因是玉米大斑病菌调控分生孢子发育、渗透胁迫调节和致病性的重要MAPK基因。本文首先构建了含有增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的毕赤酵母GSS115(Pichia pastoris GS115)表达载体p PIC3.5K-EGFP,再以玉米大班病菌模式菌株01-23的菌丝c DNA为模板,PCR扩增STK1基因,克隆到p PIC3.5K-EGFP,构建了STK1-EGFP融合基因的GS115表达载体p PIC3.5K-STK1-EGFP。利用电击转化法将该融合基因表达载体转化到GS115感受态细胞内,利用MD培养基筛选、PCR鉴定,获得了STK1-EGFP融合基因的毕赤酵母转化子。通过RT-PCR和荧光观察,发现STK1基因和EGFP基因均可以高效稳定地表达。另外,在试验中我们还发现,在STK1基因起始密码子前加入Kozak序列可以使STK1-EGFP融合基因的表达强度增强4.8倍。以上研究结果为STK1基因表达蛋白的亚细胞功能定位和抗体制备奠定了基础。     

牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达

通过PCR技术从克隆载体pMD18T-Prochy上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-Prochy,线性化后电转化毕赤酵母GS115,经PCR和测序鉴定凝乳酶原基因成功插入到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行凝乳酶的表达,SDS-PAGE分析证明重组凝乳酶的分子量约为37 kD,培养基上清液中凝乳酶的活性为12.2 SU/mL。本研究首次应用毕赤酵母表达牛凝乳酶,在培养基中获得分泌表达的重组凝乳酶,为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源。     

利用游离型表达质粒强化毕赤酵母表达木聚糖酶

巴斯德毕赤酵母是用途广泛的蛋白表达系统。目前用于毕赤酵母的质粒主要以整合型质粒为主,很少见到游离的质粒用于外源基因的表达。文中通过将来源于酵母自身的自主复制序列连接到酵母整合型表达载体pGAP中构成自主复制的游离型表达载体pGAPZαA-PARS,将该载体用于表达木聚糖酶基因。转化毕赤酵母后同传统的整合型表达菌株相比,以甘油为碳源时最高酶活达到343 U/mL,比整合型表达提高了45.9%。同时游离载体表达重组酶比活相对整合表达提高了81.2%。为了节约发酵成本,进一步研究了分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源(蔗糖︰甘油=1︰2)等不同碳源下游离型重组菌株的表达水平。发现甘油表达水平最高,蔗糖最低,但是以工业葡萄糖为碳源时产酶成本最低。由于pGAP载体不需要以甲醇为碳源,因而文中所构建的游离载体pGAPZαA-PARS极大促进了毕赤酵母在食品行业中的应用。同时,游离型载体可大幅度提高表达水平,为进一步研究提高GAP启动子的高效表达奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长抑制因子在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

血管内皮细胞生长抑制因子抑制肿瘤部位新生血管的形成,切断肿瘤细胞营养供应及废物排泄通道,抑制肿瘤细胞恶性增殖。将编码成熟的人血管内皮细胞生长抑制因子基因克隆到表达载体pPICZα中,电转化P.pastorisGS115菌株,抗生素ZeocinTM浓度梯度筛选高抗性转化子,PCR筛选阳性重组菌株。经表型鉴定后,用甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹杂交结果证实了表达产物为重组人血管内皮细胞生长抑制因子-his6融合蛋白,表达量约为5mg/L。经细胞毒性试验测定,表达产物对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖具有较明显的抑制作用。