偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法酶催化合成L-2-氨基丁酸

以廉价易得的L-苏氨酸为原料,利用在大肠杆菌中重组表达的苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶,并偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法制备L-2-氨基丁酸。以L-2-氨基丁酸的产率为指标,考察了一锅法酶催化制备L-2-氨基丁酸的最适p H、L-苏氨酸浓度及异丙醇浓度。在最适p H 7.5~8.0,L-苏氨酸浓度50g/L,添加5%的异丙醇及0.5g/L NAD+,分别加入0.6g/L苏氨酸脱氨酶、2g/L亮氨酸脱氢酶及2g/L酮还原酶,反应20h,可实现L-2-氨基丁酸的摩尔产率为99%,产量为43g/L。该结果为L-2-氨基丁酸的制备提供了一种新的思路。     

基于工程化毕赤酵母一锅法合成硫酸软骨素A北大核心CSCD

硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种线性多糖,广泛应用于医疗和保健等领域。相比于传统动物组织提取法,微生物合成硫酸软骨素具有可控、易规模化放大等优势。为实现硫酸软骨素A(CSA)的高效合成,本研究首先通过整合软骨素合酶编码基因kfoC、kfoA以及UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因tuaD至毕赤酵母GS115基因组中,构建了以甘油为唯一碳源发酵生产软骨素的毕赤酵母工程菌株。通过进一步优化软骨素合成途径,软骨素分批补料发酵水平达到2.6 g/L。在进一步整合表达软骨素-4-O-磺基转移酶的基础上,本研究通过向生产软骨素毕赤酵母工程菌株破碎液中添加3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸和软骨素-4-O-磺基转移酶,成功建立了CSA的一锅法生物合成体系。通过优化,最终实现0-40%不同磺酸化水平CSA的可控合成。本研究中CSA的一锅法生物合成体系操作简便、易放大,更适用于工业化大规模生产。本研究结果也为肝素等其他糖胺聚糖的合成提供了思路。     

重组共表达大肠杆菌细胞从D-葡萄糖一锅法生产D-甘露糖

【背景】D-甘露糖的酶促转化方法已受到相当大的关注。【目的】研究D-葡萄糖异构酶(D-glucoseisomerase,D-GIase)和D-来苏糖异构酶(D-lyxoseisomerase,D-LIase)共表达于大肠杆菌细胞生产D-甘露糖的工艺条件。【方法】将D-GIase和D-LIase基因片段合成后酶切连接到载体p CDFDuet-1上,构建p CDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI重组质粒并导入到大肠杆菌BL21(DE3)中共表达,通过摇瓶培养得到产D-GIase和D-LIase的菌体,测定该共表达细胞体系的反应条件。【结果】添加1 mmol/L Co~(2+),共表达体系酶的最适温度和p H分别为70°C和6.0。以浓度分别为100、300、500 g/L的D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖,平衡后D-甘露糖质量浓度分别为13.8、38.1、62.6 g/L,相应的转化率分别为13.8%、12.7%、12.5%,D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖的平衡比约为50:37.5:12.5。【结论】D-GIase和D-LIase在大肠杆菌细胞中组成的共表达体系通过一锅法可利用D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖。     

非天然β-氨基酸L-7-(N-苄氧羰基)氨基-3-(N-叔丁氧羰基)氨基-正庚酸的合成

以 Nε-苄氧羰基保护的 L -赖氨酸 ( L - Lys( Z) - O H)为原料 ,经过混合酸酐活化 ,与重氮甲烷反应合成重氮酮 ,再经 W olff重排 ,合成了具有光学活性的 L- 7- ( N -苄氧羰基 )氨基 - 3- ( N-叔丁氧羰基 )氨基 -正庚酸     

生物催化法合成6-氰基-（3R，5R）-二羟基己酸叔丁酯

利用E.coli BL21／pCDFDuet-gdh—cr-X共表达全细胞催化6-氰基-（5R）-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原合成6-氰基-（3R,5R）-二羟基已酸叔丁酯。结果表明：在菌体用量4．85g/L、葡萄糖与底物质量浓度比为1：1、温度28℃、pH7．0条件下,80．0g／L6-氰基-（5R）-羟基-3-羰基己酸叔丁酯生物还原2h后,底物转化率可达99．0％,产物d.e．值大于99．5％。在考察范围内,NADP^＋用量对催化效率无显著作用。