携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体的构建

目的采用体外连接技术构建含红色荧光蛋白(RFP)报告基因的重组腺病毒载体,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具。方法将pTurbo RFP-N上的含红色荧光蛋白基因片段,经酶切连接定向克隆至转移载体pShuttle上,构成重组质粒pShuttle-TurboRFP-N。用I-CeuI/PI-SceI双酶切重组质粒pShuttle-TurboRFP-N和骨架质粒pH5′040 pkGFP-II,回收目的片段,连接,获得重组腺病毒载体pH5.′040.CMV.RFP-N。将其线性化后,经脂质体介导转染至AD293细胞内包装出重组腺病毒颗粒。通过荧光显微镜观察其在AD293细胞内的包装效率和RFP表达情况。扩增并再次感染AD293细胞检测病毒颗粒感染能力,并测定其生物活性及滴度。结果经酶切鉴定,证明已正确构建重组腺病毒载体AdH5.′040.CMV.RFP-N;经AD293细胞包装成具有感染性的病毒颗粒,并能在真核细胞中高效表达目的基因;扩增纯化后获得重组腺病毒颗粒数为3.6×1012vp/mL,滴度达1×1010pfu/mL。结论成功构建了携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体,并能够在AD293细胞中高效地表达,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具。     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备

目的：利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5（LSDP5）基因的重组腺病毒。方法：从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果：LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论：成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

应用Ad Easy载体系统构建人β2-AR基因重组腺病毒

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人β2-肾上腺素能受体(β2-AR)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将β2-AR全长cDNA插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建pAdTrackCMV-β2AR重组质粒,经PmeI酶切线性化后经电击法转入含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测β2-AR的表达.结果:琼脂糖凝胶电泳显示在1242bp处有特异性条带后被克隆至腺病毒穿梭质粒.重组穿梭载体经Hind Ⅲ和Xba Ⅰ限制性酶切可以得到目的条带并经测序证实.电击法转化BJ5183所得候选重组子经PacⅠ酶切后得到30Kb腺病毒基因组片段和4.5Kb氨苄抗性片段,证实获得同源重组质粒.转染293细胞可以看到绿色荧光蛋白,以MOI100转染SD大鼠心肌细胞发现携带β2-AR的腺病毒可以在心肌细胞中过表达.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人β2-AR基因的腺病毒,为进一步研究人β2-AR基因治疗奠定了基础.     

小鼠FAM3C基因重组腺病毒载体的构建及其在肾系膜细胞中的表达

目的:利用Ad Easy TMsystem构建携带小鼠FAM3C基因的重组腺病毒,转染至人胚肾细胞系HEK293细胞,检测外源FAM3C在细胞中的表达。方法:取小鼠肾脏提取RNA,创建c DNA文库,用PCR的方法扩增FAM3C基因,将其克隆到p EASY-1载体中,T3连接酶连接。经Bgl II单酶切后,接入p Ad Tra Ck-CMV穿梭载体,T4连接酶连接,构建重组腺病毒的穿梭质粒p Ad Tra Ck-CMV-FAM3C。将经Pme I线性化的p Ad Track-CMFAM3C电穿孔共转化入BJ5183重组细菌,获取重组腺病毒质粒Ad-FAM3C,再将经Pac I线性化的Ad-FAM3C重组病毒骨架质粒转染人胚胎肾细胞系HEK293细胞,包装并扩增病毒。用Ad-FAM3C感染小鼠肾系膜细胞,Western blot法检测FAM3C在小鼠肾系膜细胞中的表达。结果:DNA序列分析和琼脂糖凝胶电泳结果表明,已构建表达FAM3C基因的重组腺病毒,该腺病毒在体外能有效感染小鼠肾系膜细胞,且高表达FAM3C蛋白。结论:成功地构建了携带小鼠FAM3C基因的重组腺病毒,为进一步阐明FAM3C的功能及作用机制奠定实验基础。     

果蝇硒蛋白dSelK基因重组腺病毒构建与表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统构建果蝇硒蛋白dSelK基因重组腺病毒并在AD-293细胞中包装扩增。方法:PCR扩增dSelK目的片段连接到穿梭载体pShuttle-CMV上,用电转化法将线性化的pShuttle-CMV-dSelK穿梭载体转入含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细胞中,构建重组腺病毒载体AdEasy-dSelK,线性化后转染AD-293细胞进行包装,并传代扩增,TCID50法测病毒滴度,Western blot鉴定。结果:成功构建腺病毒载体AdEasy-dSelK,经AD-293细胞包装扩增得到重组腺病毒,滴度为107.5。Western blot鉴定AdEasy-dSelK成功表达。结论:成功构建重组腺病毒载体pAdEasy-dSelK,为硒蛋白功能研究奠定基础。     

表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体并鉴定.方法:采用PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得SEA全长基因序列,酶切后克隆入pCA13质粒,构建重组病毒质粒pCA13-SEA.将鉴定正确的pCA13-SEA与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-SEA.Ad-SEA在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度.结果:经PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,SEA基因成功克隆到溶瘤腺病毒载体中,可实现SEA基因的表达.结论:成功构建了表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体,为进一步研究该病毒对膀胱肿瘤靶向治疗的作用奠定了基础.     

汉坦病毒包膜糖蛋白G2重组腺病毒的构建及其在Hela细胞中的表达

本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒;用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白,间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体;RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录;荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞,可见报告基因eGFP的表达;间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别,表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒,转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白,为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。     

人Sef基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

构建人Sef-L和Sef-S基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 为研究Sef的功能和作用机制以及Sef的基因治疗奠定基础。通过PCR方法以hSef的表达质粒为模板扩增得到hSef的编码序列, 亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV中, 经测序验证之后, 将穿梭载体使用Pme I酶切线性化, 然后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183, 得到重组的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒, 最后将Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒使用Pac I线性化, 转染到HEK293细胞中, 包装收获病毒颗粒, 免疫印迹实验鉴定表达, 荧光素酶报告实验验证其功能。成功构建了人Sef基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 获得了有功能的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S病毒重组子。     

人Sef基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

构建人Sef-L和Sef-S基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 为研究Sef的功能和作用机制以及Sef的基因治疗奠定基础。通过PCR方法以hSef的表达质粒为模板扩增得到hSef的编码序列, 亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV中, 经测序验证之后, 将穿梭载体使用Pme I酶切线性化, 然后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183, 得到重组的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒, 最后将Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒使用Pac I线性化, 转染到HEK293细胞中, 包装收获病毒颗粒, 免疫印迹实验鉴定表达, 荧光素酶报告实验验证其功能。成功构建了人Sef基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 获得了有功能的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S病毒重组子。     

人核糖核酸酶抑制因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含有人核糖核酸酶抑制因子（hRI）基因的重组腺病毒载体。方法以含有全长cDNA的pT7-RI为模板,PCR扩增hRI,经T载体克隆后,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack—CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组。筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增。通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果酶切鉴定及PCR结果证明hRI基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为1．5×10^10 pfu/ml。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含hRI基因的重组腺病毒载体。     

SOCS3基因重组腺病毒的构建及其在猪脂肪细胞中的表达

本研究旨在构建细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的重组腺病毒表达载体,获得有感染性的病毒颗粒。以pcDNA3-SOCS3质粒为模板扩增SOCS3基因,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经测序验证后,重组的穿梭质粒用PmeI酶切线性化后转化到BJ5183感受态细菌中与其内的骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,获得的重组质粒pAd-SOCS3,经PacI线性化后转染至HEK293细胞中进行包装和扩增,纯化后用TCID50法测定病毒滴度。以重组的病毒感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒载体pAd-SOCS3经酶切及PCR鉴定正确,病毒滴度为1.2×109PFU/mL;感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜观察可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western blotting检测到细胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表达显著提高。本研究成功构建了SOCS3基因的重组腺病毒,感染原代培养的猪脂肪细胞可稳定表达SOCS3蛋白,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白重组人腺病毒的构建及免疫效果的初步研究

构建表达狂犬病病毒弱毒SRV9糖蛋白(GP)的重组人5型腺病毒,检测其对小鼠的免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆到腺病毒表达系统中的穿梭质粒多克隆位点,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-Gs9,以罗氏转染液介导线性化骨架质粒和重组穿梭质粒共转染293AD细胞,细胞病变后取培养物进行PCR鉴定并电镜观察,在293AD细胞上测定病毒滴度。以106 TCID50重组腺病毒腹腔接种昆明小鼠,免疫后不同时段采尾静脉血通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测小鼠血清狂犬病中和抗体效价。正确构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-Gs9;获得表达狂犬病病毒SRV9株GP蛋白的缺陷型重组人5型腺病毒;病毒滴度达到106 CFU/mL以上;腹腔接种小鼠14d后均产生了抗狂犬病中和抗体,有效保护率达90%。成功获得了表达狂犬病病毒GP基因的重组腺病毒,该腺病毒免疫小鼠可产生保护性中和抗体,为进一步开发新型兽用狂犬病疫苗奠定了物质基础。     

MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定

目的构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体,并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响,为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具。方法人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA;在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染表达MKRN1的HeLa细胞株,用RT-PCR法及Western印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响,用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化。结果成功构建了MKRN1的siR-NA重组腺病毒载体;MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达,并显著上调细胞中端粒酶的活性。结论构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性,从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具。     

HCV core 1b亚型和HA共表达重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的：构建HCV core 1b亚型和HA共表达的腺病毒载体并予以鉴定。方法：合成HCV核心蛋白1b亚型的核苷酸,连接入pcmv5-HA质粒中。用XhoⅠ单酶切,后用Klenow酶补平,再用HindⅢ单酶切下HA-HCV core 1b片段,连入pShuttle-cmv穿梭质粒中,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-HA core 1b.将pShuttle-CMV-HA core 1b转化至含有AdEasy-1的BJ5183感受态细菌中进行同源重组。PacⅠ酶切线性化重组质粒pAd-HA-HCV core 1b并转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。用RT-PCR检测HA-HCVcore 1b的mRNA的表达水平,并用Western blot检测融合表达蛋白HA-HCV core 1b的表达水平。结果：穿梭质粒pShuttle-CMV-HA-HCV core 1b经PCR和测序证实构建成功。重组腺病毒载体经AD293细胞包装后,可观察到CPE现象。用获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞,经RT-PCR检测,在mRNA水平上有表达;经Western blot检测,HCV core 1b亚型腺病毒载体（Ad-HA-HCV core 1b）感染组与未感染腺病毒载体组及空白对照组相比,只有Ad-HA-HCV core 1b感染组有融合蛋白HA-HCVcore 1b的表达。结论：通过分子克隆体外重组技术,成功构建了HCV core 1b亚型和HA共表达的重组腺病毒载体Ad-HA-HCVcore 1b。为进一步研究丙型肝炎病毒1b亚型引起丙肝感染中胰岛素抵抗的作用机制提供了方法。     

小鼠 LRRC 10腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的表达

目的：构建含有小鼠Lrrc10（Leucine-rich Repeat Containing protein 10）基因的重组腺病毒表达载体。方法：设计小鼠Lrrc10特异性引物,以小鼠cDNA为模板,通过PCR扩增出mLrrc10的编码区,并引入HA标签蛋白和Sal Ι酶切位点。该片段经凝胶电泳纯化后插入pMD-18 T载体。测序后,用Sal Ι和Hind III酶切,将目的片段亚克隆至pAd-track-cmv穿梭载体中。用PmeΙ线性化后,用100 ng转化细菌BJ5183,在细菌内同源重组后得到 pAd-Lrrc10质粒。pAd-Lrrc10经PacⅠ线性化后用LipofectamineTM2000转染293A细胞,包装得到含Lrrc10基因的病毒重组子。将病毒重组子在293A细胞中扩增后,反复冻融得到滴度较高的含Lrrc10的病毒液。将收集的病毒液感染心肌细胞,绿色荧光观察 GFP、免疫印迹检测Lrrc10-HA蛋白的表达。结果：用病毒液感染原代心肌细胞,24小时后在荧光显微镜下可观察被感染的细胞发出绿色荧光,提取心肌细胞总蛋白,Western可检测到Lrrc10-HA融合蛋白的表达。结论：小鼠Lrrc10腺病毒载体构建成功,并可将编码Lrrc10-HA的目的片段导入心肌细胞中表达。     

腺病毒介导重组hKGF基因转染HaCat细胞及其表达

将PCR扩增得到的人角质细胞生长因子（hKGF）基因片断插入穿梭载体pAdTrack-CMV,产生重组质粒pAdTrack-CMV-hKGF,经Pme I线性化后,通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAdEasy-hKGF。采用Lipofectamine 2000将pAdEasy-hKGF转染到HEK-293细胞,在HEK-293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有hKGF基因。获得的重组hKGF腺病毒感染颗粒可高效感染HaCat细胞。Western-blot结果显示,重组腺病毒感染的HaCat细胞可分泌表达hKGF蛋白。     

用大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组

利用大肠杆菌细胞内质粒间同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组 DNA,高效构建携带有外源基因的均一重组腺病毒 .将带有狂犬病毒糖蛋白 (GP)基因和加强型 GFP(enhanced GFP,EGFP)表达盒的重组穿梭质粒 p Ad- Track- CMV/ GP与腺病毒骨架载体质粒 p Ad Easy- 1一起同时电击共转化大肠杆菌 BJ51 83.在 BJ51 83细胞内 ,带有同源序列的重组穿梭质粒与骨架载体可进行同源重组 ,得到以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组 p Ad- GP’.以 p Ad- GP’为模板 ,经DNA测序确认 GP基因成功整合入此质粒中的腺病毒基因组 E1区外源基因表达盒中 .线形化的p Ad- GP’转染 2 93细胞后可得到基因组结构均一、在 E1区插入有 GP和 EGFP表达盒的重组腺病毒 ,病毒滴度可达 1× 1 0 8pfu/ ml.电镜下此重组病毒颗粒直径约为 70 nm,略呈球形 ,用荧光显微镜观察感染细胞有很强的 EGFP表达 .实验表明 :利用大肠杆菌同源重组获得克隆化的重组腺病毒基因组 DNA,可高效制备高滴度的均一重组腺病毒     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。