透明颤菌血红蛋白的表达及对基因工程菌的影响

利用已克隆的透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb),构建了一批复制类型和抗生标记不同的vgb表达载体,并就vgb基因表达及其对几种基因工程大肠杆菌的影响进行了初步研究。实验证明vgb基因的表达具有氧调控特性,在溶氧水平下跌至20％饱和度时迅速合成。Vgb基因的表达产物(Vitreoscilla Hemoglogin,VHb)可促进青霉素酰化酶和TNF、IL-2等基因工程菌在低氧条件下细胞生长和产物表达的状况,由于vgb基因的表达降低了细胞对氧的敏感程度,可望运用它来改善发酵过程中溶氧控制裕度。这些实验结果预示着vgb基因在耗氧生物过程中,如抗生素工业和基因工程菌高密度发酵,有着良好的应用前景。     

透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对其细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌(S.cinnamonensis)是莫能菌素(Monensin)的产生菌。大肠杆菌链霉菌穿梭表达载体pHZ1252中的透明颤菌血红蛋白基因(vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子P_tipA之下,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定,发生了重组缺失,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分和vhb基因。但来自阿维链霉菌(S.avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的pHZ1252,可在肉桂地链霉菌中稳定复制,不再发生缺失,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的VHb蛋白。摇瓶发酵实验证明,VHb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。     

透明颤菌血红蛋白的分离纯化与分析检测

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin,VHb)是惟一一种研究得较为透彻的原核生物氧结合蛋白血红蛋白。它支持细胞在微氧条件下进行好氧生长,克服发酵过程中的溶氧限制,因此在需氧微生物发酵工业中具有重要的应用价值。简述了VHb的分离纯化过程,综述了VHb的各种定性检测和定量分析方法,比较了各种检测分析方法的优缺点和适用性。提出利用改进的一氧化碳差光谱法以全细胞悬浮液为对象直接进行VHb的定量分析是发酵工业中应用VHb重组菌株的研究发展方向 。     

透明颤菌血红蛋白基因在产PHB重组大肠杆菌中的引入

将透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)采用插入染色体的方式引入产聚 β 羟基丁酸酯(PHB)重组大肠杆菌VG1 (pTU1 4)中 ,以从分子水平上提高克隆菌对氧的利用率 ,解决PHB发酵生产过程中的供氧矛盾 ,透明颤菌血红蛋白的一氧化碳差光谱分析明表 ,vgb基因可以在VG1 (pTU1 4)中成功表达 ,且其表达量受溶氧水平的调控。Vgb基因的引入可以同时促进菌体生长和PHB产品的积累 ,且溶氧水平越低 ,VHB表达量越高 ,这种促进作用就越明显     

受溶氧浓度调控的新型大肠杆菌表达系统

利用透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白基因在大肠杆菌中的转录过程受环境溶氧浓度调控,在贫氧条件下基因转录被激活的性质,构建了一个在贫氧条件下能高效表达外源基因的新型大肠杆菌表达系统。该表达系统包括一个古血红蛋白基因启动子元件控制T7RNA聚合酶基因表达的低拷贝质粒的宿主菌GJ100和另一个T7启动子控制外源基因表达的质粒载体。研究结果表明大肠杆菌本身的硫氧还蛋白,原核生物的金黄色葡萄球菌A蛋白IgG结合区(ZZ),真核生物的蛇神经毒素融合蛋白,鲑鱼降钙素六聚体,人白细胞介素Ⅱ和人尿激酶原等基因均能在该系统中获得高效表达。重组蛋白表达的水平可达细胞总蛋白的30％以上。     

细菌血红蛋白基因在产D-阿拉伯糖醇酵母菌中的克隆与表达

构建了含透明颤菌血红蛋白基因vgb和甲醛抗性基因SFA1的重组质粒pVgb EX2 ,转化到产D 阿拉伯糖醇的酵母Saccharomycessp.X 62中。转化子细胞中VHb的含量比对照菌细胞有显著提高 ,表明基因vgb在酵母细胞中得到表达。转化子发酵的D 阿拉伯糖醇产量与转化率均有提高。在重复实验中D 阿拉伯糖醇的产量最多提高了 2 7 3%。在实验条件下 ,似乎D 阿拉伯糖醇的产量与细胞VHb含量有相关性。     

毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达

解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了改善高密度发酵生产Y1Lip2过程中的溶氧限制,提高Y1Lip2的表达量,将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb分别置于AOXl启动子和PsADH2启动子的调控之下,进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达.PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis,在低氧条件下能被激活.SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明,Y1Lip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达.在氧限制性条件下,VHb表达的细胞(VHb+,GS 115/9Klip2-pZPVT)与对照细胞(VHb-,GS 115/9Klip2)相比,摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25％和83％.此外,在低氧条件下,VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb-细胞高.文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS 115/9Klip2-pZP VTlip2 49#,在低氧条件下,该克隆子在10L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL.因此,在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb,同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略.     

透明颤菌血红蛋白基因克隆及植物表达载体的构建

透明颤菌血红蛋白是一种专性好氧的氧结合蛋白。目的:以VHb基因构建植物表达载体,并在大肠杆菌中实现表达。方法:使利用试剂盒提取透明颤菌血红蛋白的总DNA,以其为模板通过PCR克隆VHb基因。结果:克隆得到VHb基因片段的长度约为0.5kb,与NCBI上公布的VHb基因序列最大同源性达99%。结论:通过酶切鉴定及PCR检测,成功构建重组植物表达载体p3300-vhb-super promoter-Tnos。     

共表达透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

为了改善高密度发酵生产β-甘露聚糖酶过程中的溶氧限制,提高β-甘露聚糖酶产量,将VHb和β-甘露聚糖酶基因置于AOX1启动子调控之下,进行VHb和β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达。经密码子优化合成VHb基因,插入表达载体p PICZαA,整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,通过G418和Zeocin抗性筛选共表达VHb基因的重组酵母工程菌。在30 L发酵罐水平上分析共表达VHb菌株(VHb+)与初始菌株(VHb-)对β-甘露聚糖酶表达的差异。结果显示,限氧条件下,VHb+菌株的β-甘露聚糖酶的表达量比对照菌株VH b-高90%,且透明颤菌血红蛋白提高了甲醇耐受性,缩短发酵周期约40 h。     

一氧化氮和氧自由基诱导缺氧再给氧心肌细胞凋亡的bcl-2和p53信号通路研究

观察了心肌缺氧再给氧损伤的一氧化氮(nitric oxide, NO)和氧自由基机制. 新生Wistar大鼠心肌细胞置于95% N₂ /5% CO₂环境培养24 h, 然后置于95% O₂ /5% CO₂环境培养4 h造成缺氧再给氧心肌细胞损伤模型. 单纯缺氧组心肌细胞置于95% N₂/5% CO₂环境培养24 h, 但不再给氧. NO供体硝普钠(SNP, 5 mmol/L)、NO合酶抑制剂Nw-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME, 100 mmol/L)和其异构体Nw-硝基-D-精氨酸甲酯(D-NAME, 100 mmol/L)以及超氧化物歧化酶/过氧化氢酶(SOD/CAT, 各100 U/mL)分别于缺氧前加入培养基. 正常对照组心肌细胞置于95% 空气/5% CO₂环境下培养. 结果显示, 缺氧24 h能增加培养介质中NO, 硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和乳酸脱氢酶(LDH)水平, 再给氧降低培养介质中NO和 水平, 增加TBARS和LDH水平. 缺氧上调bcl-2和p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 而再给氧下调bcl-2蛋白表达水平, 上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平. 同时, 缺氧增加心肌细胞凋亡率, 而再给氧增加心肌细胞坏死率. NO供体硝普钠(SNP)增加培养介质中 和TBARS水平, 下调bcl-2蛋白表达而上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 增加DNA断裂、凋亡及坏死细胞率. L-NAME和 SOD/CAT分别降低培养介质中 和TBARS水平, 它们均能上调bcl-2蛋白表达而下调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 抑制DNA断裂、凋亡及坏死细胞率, 而D-NAME则无此作用. 以上结果表明, 在缺氧再给氧所致心肌细胞死亡过程中, NO和氧自由基参与下调bcl-2蛋白表达水平和上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 相应地激发细胞凋亡程序, 并提示一氧化氮及氧自由基诱导心肌细胞凋亡的机制与调节 bcl-2和p53和p21/waf1/cip1信号通路有关.     

Expression of vitreoscilla hemoglobin improves growth and levels of extracellular enzyme in Yarrowia lipolytica

Enhancement in oxygen uptake by high-cell-density cultivations has been achieved previously by expression of the bacterial hemoglobin gene from Vitreoscilla. The Vitreoscilla hemoglobin (VHb) gene was expressed in the yeast Yarrowia lipolytica to study the effect of expression in this commercially important yeast. The expression of VHb in this yeast was found to enhance growth, contrary to reported observations in wild-type Saccharomyces cerevisiae in which there was no significant growth enhancement. VHb-expressing Y. lipolytica exhibited higher specific growth rate, enhanced oxygen uptake rate, and higher respiratory activity. We report the beneficial effects of VHb expression on growth under microaerobic as well as under nonlimiting dissolved oxygen conditions. Earlier studies in Y. lipolytica have demonstrated inhibition of mycelia formation by respiratory inhibitors and poor nitrogen source, conditions poor for growth. VHb(+) Y. lipolytica cells were more efficient at forming mycelia, indicating better utilization of available oxygen as compared with the VHb(-) cells. Expression of VHb was also found to increase the levels of enzyme ribonuclease secreted into the medium, a property that may be beneficial for producing heterologous proteins in Y. lipolytica.     

透明颤菌血红蛋白基因的研究与应用

总结了近 15年来透明颤菌血红蛋白的研究结果 ,包括它的分布、结构、功能、合成等分子生物学以及在基因工程中的应用。透明颤菌的血红蛋白是 2 0世纪 70年代被发现的 ,由于它具有结合氧的特性 ,可使透明颤菌这一专性好氧的革兰氏阴性菌在贫氧环境中生长。透明颤菌血红蛋白是同型二聚体形式的可溶性血红蛋白分子 ,每分子透明颤菌血红蛋白由两个分子量为 15 775的亚基和两个b型血红素组成。透明颤菌血红蛋白的功能是为透明颤菌强大的呼吸膜增加氧的流量。完整的有功能的血红蛋白由血红蛋白亚基和血红素组成 ,血红蛋白亚基由基因vgb编码 ,血红素由生化代谢合成。透明颤菌血红蛋白基因在野生透明颤菌中是以单拷贝的方式随染色体一起复制表达的。透明颤菌血红蛋白基因已经被克隆和测序。同时也讨论了将透明颤菌血红蛋白基因整合到异源宿主菌中增加重组蛋白产量和发酵产量方面的研究。最后 ,概述了当透明颤菌血红蛋白在植物中表达时 ,转基因植物表现出生长增加以及代谢物产量发生变化的情况。     

从透明颤菌血红蛋白谈到植物缺氧与转基因作物

扼要介绍透明颤菌血红蛋白基因在多种微生物的表达、调节和生理功能,特别是在生物工程方面可能的应用。但最值得重视的是这一基因在烟草中的表达及其生理效应,它为我们提出一个重要的问题,就是植物是否缺氧,透明颤菌血红蛋白基因很可能是构建转基因作物的重要元件。     

Vitreoscilla hemoglobin. Intracellular localization and binding to membranes

The obligate aerobic bacterium, Vitreoscilla, synthesizes elevated quantities of a homodimeric hemoglobin (VHb) under hypoxic growth conditions. Expression of VHb in heterologous hosts often enhances growth and product formation. A role in facilitating oxygen transfer to the respiratory membranes is one explanation of its cellular function. Immunogold labeling of VHb in both Vitreoscilla and recombinant Escherichia coli bearing the VHb gene clearly indicated that VHb has a cytoplasmic (not periplasmic) localization and is concentrated near the periphery of the cytosolic face of the cell membrane. OmpA signal-peptide VHb fusions were transported into the periplasm in E. coli, but this did not confer any additional growth advantage. The interaction of VHb with respiratory membranes was also studied. The K(d) values for the binding of VHb to Vitreoscilla and E. coli cell membranes were approximately 5-6 microm, a 4-8-fold higher affinity than those of horse myoglobin and hemoglobin for these same membranes. VHb stimulated the ubiquinol-1 oxidase activity of inverted Vitreoscilla membranes by 68%. The inclusion of Vitreoscilla cytochrome bo in proteoliposomes led to 2.4- and 6-fold increases in VHb binding affinity and binding site number, respectively, relative to control liposomes, suggesting a direct interaction between VHb and cytochrome bo.     

在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白需要异源启动子

构建了质粒pIJ4083Mpro、pIJ4083\|pro\,pWLD8和pFW3。在浅青紫链霉菌TK24中,启动子探针质粒pIJ4083上的邻苯二酚双加氧酶基因(xylE)不能被透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的启动子带动转录,表明vgb启动子在链霉菌中无作用。TK24中,pWLD8和pFW3均能表达透明颤菌血红蛋白(VHb),pWLD8上可能是由Plac带动vgb的表达;pFW3上vgb基因去掉了非必要部分,克隆在PCR扩增得到的glnA启动子下游,两者连成嵌合基因。