致赤大袋鼠皮肤化脓的荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

正多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)是巴氏杆菌属的成员之一,能感染鸡、鸭、兔、猪和牛等多种家养动物和部分野生动物,不同动物感染后的疾病命名不同,如禽霍乱(Eveleth et al.,1949)、猪肺疫和牛出血性败血症(陆承平,2001)。该菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌,新分离菌株瑞氏染色两极着色明显,有荚膜,人工培养     

多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株的构建及鉴定

【目的】构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,并验证其致病性。【方法】采用正向筛选同源重组技术构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,利用PCR对突变株进行鉴定,分析其遗传稳定性、生长特性和致病性。【结果】成功构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,连续传代20代,遗传稳定;突变株体外生长曲线表明,在前6h生长速度稍慢于亲本菌,随后两者生长速度一致。对小鼠的致病性试验表明:经腹腔注射aroA基因缺失突变株在1.0×106 CFU对小鼠无致死性,而亲本菌株在1.0×102 CFU对小鼠是致死性的。【结论】本研究获得多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,对小鼠的致病性是减弱的。多杀性巴氏杆菌突变株的构建有助于研究其致病机理。     

多杀性巴氏杆菌抗原的研究进展

多杀性巴氏杆菌在自然界分布广泛,是畜、禽、野生动物及人类的一种共患性病原,可以在同种和不同种的动物间传播,并引起多种畜禽巴氏杆菌病,本文就多杀性巴氏杆菌的抗原成分进行概述。     

多杀性巴氏杆菌分子分型方法简述

多杀性巴氏杆菌是一种能感染多种动物甚至是人的重要革兰氏阴性病原菌。目前临床上用于多杀性巴氏杆菌诊断的分型方法主要包括血清学分型方法和分子分型方法。其中血清学分型方法主要基于免疫学实验技术建立,操作过程繁琐,技术要求高,工作量大,不适用于临床上大规模快速开展多杀性巴氏杆菌流行病学调查的需要;而基于分子生物学手段建立的分子分型方法相对于传统的血清学分型方法而言具有快速、简单、灵敏、灵活等特点,特别是某些分子分型方法与传统的分型方法形成了较为精确的对应关系,因而在临床上得到了广泛的应用。目前适用于临床上开展多杀性巴氏杆菌分离鉴定的分子分型方法主要包括多重PCR方法及多位点序列分型法(MLST),其中多重PCR方法又包括基于荚膜编码区及脂多糖外核编码簇建立的PCR方法。本文将重点就这3种常用的多杀性巴氏杆菌分子分型方法进行综述,介绍其建立原理、实现手段以及各自的优缺点,为临床上开展多杀性巴氏杆菌的流行病学调查特别是分子流行病学调查提供参考。     

牛源多杀性巴氏杆菌的分离与初步鉴定

【目的】本研究旨在对引起犊牛呼吸道综合征的多杀性巴氏杆菌进行分离鉴定,分析其亲缘关系和毒力基因的分布情况。【方法】收集2017年8月至2018年4月疑似患有犊牛呼吸道综合征的病牛鼻拭子进行细菌分离培养,对菌落形态和染色疑似巴氏杆菌的菌株进行16S rRNA测序和血清型鉴定,选择巴氏杆菌7类23种毒力基因,筛查临床分离株的毒力基因的分布。【结果】从8个省份的237份病料中分离出31株多杀性巴氏杆菌,分离率为13.1%。16S rRNA测序分析表明31株A型多杀性巴氏杆菌属于同一亚群,其序列同源性与中国分离株HB01以及国外分离株USDA-ARS-USMARC-60712、USDA-ARS-USMARC-60214、ATCC 43137以及36950亲缘关系较近。对分离出的31株A型多杀性巴氏杆菌的7类共23种毒力基因鉴定,结果显示31株多杀性巴氏杆菌所携带的毒力因子大多分布在17–19个,且集中度较高。【结论】A型多杀性巴氏杆菌为犊牛呼吸道综合症的主要流行血清型,通过对多杀性巴氏杆菌的临床分离株进化树和毒力基因分析,内蒙古、黑龙江、新疆、山西以及河北的7株分离株进化来源于同一分支,且均缺失毒力基因tadD和hgbA及携带毒力基因hsf-1,提示着其亲缘关系可能与其携带的特定毒力基因存在一定相关性。该研究为犊牛呼吸道综合征的病原学调查和多杀性巴氏杆菌流行病学调查提供了参考数据。     

基于响应面法的高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基的研制与效果评价

【背景】禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)引发的禽霍乱疫情造成了巨大的危害,而现有培养基存在培养菌密度较低的问题。【目的】研制高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基。【方法】通过单因素试验、Plackett-Burman试验和响应面分析方法对禽多杀性巴氏杆菌培养基的成分进行调整,并对不同发酵阶段的菌体进行免疫原性测定。最后使用该培养基培养细菌后制备疫苗并通过动物攻毒试验评价其保护效果。【结果】使用研制的培养基培养禽多杀性巴氏杆菌,活菌密度能够在6 h达到约1.84×1010 CFU/mL,增菌效果是对照培养基的2.6倍;免疫原性测定结果显示在生长平台期菌体的抗原活性最高;攻毒试验表明制备的疫苗能够很好地抵抗禽多杀性巴氏杆菌的侵袭。【结论】研制出了高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基,为疫苗的生产奠定了基础。     

巴氏杆菌糖酵解酶的黏附作用研究

巴氏杆菌（主要是多杀性巴氏杆菌）可以引起多种动物疫病（巴氏杆菌病）,同时也引起人类感染发病。[目的] 研究巴氏杆菌糖酵解酶对宿主细胞（兔肾细胞）和两种常见分子[纤连蛋白（fibronectin,Fn）和血浆纤维蛋白溶解酶原（plasminogen,Plg）]的黏附作用。[方法] 采用原核表达系统对多杀性巴氏杆菌的糖酵解酶进行表达并纯化及制备多克隆抗体,通过菌体表面蛋白定位检测、黏附与黏附抑制等实验探究巴氏杆菌糖酵解酶的黏附作用。[结果] 菌体表面蛋白检测结果显示除烯醇化酶和丙酮酸激酶外的7个糖酵解酶在多杀性巴氏杆菌表面存在。这7个糖酵解酶均能黏附兔肾细胞,但仅有磷酸葡萄糖异构酶的多克隆抗体能对多杀性巴氏杆菌黏附宿主细胞产生抑制作用。Far Western blotting结果显示9个糖酵解酶均能结合宿主Fn和Plg。招募抑制实验结果显示磷酸葡萄糖异构酶、醛缩酶、磷酸甘油酸变位酶的抗体对多杀性巴氏杆菌结合Fn和Plg都有抑制作用,磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油激酶抗体仅对多杀性巴氏杆菌结合Fn或Plg有抑制作用。[结论] 多杀性巴氏杆菌糖酵解酶成员葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油激酶、磷酸甘油酸变位酶在多杀性巴氏杆菌黏附宿主细胞或分子过程中发挥作用。该研究的完成将加深巴氏杆菌病分子发病机制的认识,并为巴氏杆菌病的诊断标识筛选、新型疫苗创制和药物靶标筛选等提供基础数据。     

牛巴氏杆菌病多重PCR检测技术的建立与应用

【背景】牛巴氏杆菌病是由血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一种严重危害养牛业的重要传染病,病原学聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法是诊断并防控该病的有效手段。【目的】建立检测血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌的多重PCR方法,为临床诊断牛巴氏杆菌病和病原分型提供技术支撑。【方法】参考多杀性巴氏杆菌hyaD-hyaC基因、bcbD基因和ecbJ基因特异区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定适宜退火温度(T_m);采用棋盘试验优化引物浓度并初步建立多重PCR方法;采用重组质粒标准品及阳性菌株菌液确定其敏感性(最小检测量);以8种常见牛感染病原体[溶血性曼氏杆菌(Mannheimia hemolytica)C1655、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)C237、产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes)C1597、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)C3053、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)C79351、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)C1625、牛传染性鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus)CAV1546和牛支原体分离株(Mycoplasma bovis)C65-1]核酸样本确定其特异性;制备3批诊断试剂,对敏感性和特异性样品进行批间和批内试验,确定其重复性;运用建立的方法使用3种不同型号的PCR仪检测敏感性和特异性样品,确定其适用性;通过检测临床样本及人工模拟感染样本评价临床应用效果。【结果】在T_m为55℃时,3对引物浓度分别为0.25、0.30和0.20μmol/L条件下建立多重PCR方法较优,可以同时检测多杀性巴氏杆菌血清A型(821bp)、血清B型(203bp)和血清E型(363bp);该方法敏感性高,对重组质粒标准品pMD-A、pMD-B和pMD-E检测限分别为43.080、3.710和4.350copies/μL,对阳性菌液最低检出限均为10²CFU细菌;其特异性强,仅对血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌有特异性扩增条带,同时对其他病原体均无扩增条带;该方法重复性良好,批间与批内试验均一致;临床样本及人工模拟感染样本检测结果显示与病原分离鉴定符合率为100%。【结论】成功建立了一种可鉴定不同血清型的牛多杀性巴氏杆菌多重PCR检测方法。     

抗多杀性巴氏杆菌植物乳杆菌细菌素的生物学特性研究

目的 针对多杀性巴氏杆菌耐药性不断增强的情况,寻找替抗产品。方法 使用MRS培养基分离酸菜中的乳酸菌菌株,采用16S rRNA基因测序鉴定分离菌株。对分离菌株进行发酵培养,研究其无菌发酵上清液对酶的敏感性、热稳定性、酸碱稳定性和其抑菌谱。结果 分离得到了1株优势乳酸菌YWH-4,经过16S rRNA基因测序鉴定该菌株为植物乳杆菌。植物乳杆菌YWH-4发酵上清液对胃蛋白酶具有高敏感性,推测其发酵上清液中具有抗菌活性物质细菌素。该细菌素具有良好的热稳定性,经100℃处理2 h后仍有较强抑菌活性;具有酸碱稳定性,在pH值3.0～5.0之间保持良好抑菌活性。结论 植物乳杆菌YWH-4所产细菌素对多杀性巴氏杆菌具有良好的抗菌活性。     

牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH的扩增与生物信息学分析

旨在扩增牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH的编码基因,并预测OmpH蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH在免疫保护中所起的作用。对牦牛多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白OmpH基因进行PCR扩增及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH基因全长1 478 bp,ORF包含1 002 bp编码333个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和延伸带;推测OmpH蛋白有1个细胞黏附位点、2个糖基化位点。     

多杀性巴氏杆菌攻毒小鼠肺脏的转录组分析

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)可感染多种动物宿主并引发败血症和呼吸道疾病,危害动物健康,给养殖业带来严重经济损失。本研究为探究多杀性巴氏杆菌感染期间对宿主肺脏基因表达的影响,选取羊源A型多杀性巴氏杆菌对小鼠(Mus musculus)进行攻毒实验,攻毒后72 h采集小鼠肺脏组织并提取总RNA。基于转录组测序,与对照组相比,攻毒组获得2 443个差异表达基因,其中有1 437个基因上调,1 006个基因下调。对2 443个差异表达基因进行GO富集分析,结果显示,差异基因显著富集的GO terms主要有B细胞稳态、T细胞迁移的正调控、整合素复合物和胶原蛋白结合;KEGG富集分析结果显示,差异基因显著富集于11条免疫炎症信号通路,包括细胞因子与细胞因子受体互作、趋化因子信号通路等;免疫炎症相关信号通路中,差异基因经蛋白质-蛋白质互作分析,结果显示,C3、C3ar1、C5ar1、Cxcl10、Cxcr2和Gng11基因处于网络中心,说明这些基因在多杀性巴氏杆菌感染过程中发挥了重要作用;从11条免疫炎症通路的基因中挑选10个进行实时荧光定量PCR验证,发现有8个基因...     

猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌多重实时荧光PCR方法的建立

【背景】猪链球菌(Streptococcus suis,SS)和猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)都是能引起宿主致病的人畜共患病原菌,常出现混合感染,临床诊断上易与猪瘟、猪丹毒等混淆。【目的】快速、有效鉴别猪链球菌病和猪多杀性巴氏杆菌病,建立一种能同时检测2种病原的多重实时荧光定量PCR检测方法。【方法】基于猪链球菌的gdh基因和猪多杀性巴氏杆菌的plpE基因,设计2对特异引物及TaqMan探针,以细菌16S rRNA基因设计通用引物及探针,通过对反应条件优化,建立了一种能同时检测猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌的多重实时荧光定量PCR检测方法。【结果】该方法能够特异性地检测猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌,与细菌分离后的测序结果验证完全一致。此方法对重组质粒标准品的最低检出浓度分别为4.53×10²copies/μL和3.97×10²copies/μL。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于3%。【结论】本实验所建立的方法准确、简便、可靠,能够用于2种病原菌的同时检测,为猪链球菌病和猪多杀性巴氏杆菌病的防治提供了有效的检测工具,具有重要的流行病学意义和临床应用价值。     

嗜肺巴氏杆菌在实验大鼠和小鼠中的传染性研究

目的观察不同来源的嗜肺巴氏杆菌在实验大鼠和小鼠中的传染性.方法取源于野鼠、实验大鼠和小鼠的嗜肺巴氏杆菌3株,对30只受试大鼠和小鼠进行交叉人工感染,并于感染后不同时期取咽拭子分离培养,对感染前后菌株,应用RAPD-PCR、SDS-PAGE和Western blot进行基因型、蛋白和抗原成份比较,以及生物学特性的比较.结果受试实验动物对3株嗜肺巴氏杆菌均易感,被接种的动物能稳定携带嗜肺巴氏杆菌直到试验结束,重新分离的嗜肺巴氏杆菌在生物学特性、蛋白成份、抗原性和基因型方面无明显改变.结论同一株嗜肺巴氏杆菌能在实验大鼠和小鼠中相互传染.     

利用16SrDNA建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌

鸭疫里默氏菌感染是危害养鸭业的主要疾病,用表型指标鉴定鸭疫里默氏菌存在不足,因此有必要建立检测该菌的种特异性PCR法。利用已登录的鸭疫里默氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌的16S rDNA基因序列,设计了一对鸭疫里默氏菌16S rDNA基因的特异性引物190f和843r,分别以基因组DNA和菌落提取液为模板,从1-19型鸭疫里默氏菌参考菌株和代表亚型、变异株和可能新型的国内分离株共26株细菌中均扩增出大小为654bp的特异性片段,而扩增鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌和禽多杀性巴氏杆菌等感染鸭的常见细菌的结果均呈阴性。分别将鸭疫里默氏菌基因组DNA和菌落提取液进行10倍梯度稀释,基因组DNA的最小检出量为50pg,菌落最小检出量为15CFU／mL。结果说明,该PCR法具有较好的特异性和敏感性,可用于快速鉴定鸭疫里默氏菌。     

利用16S rDNA建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌

鸭疫里默氏菌感染是危害养鸭业的主要疾病,用表型指标鉴定鸭疫里默氏菌存在不足,因此有必要建立检测该菌的种特异性PCR法。利用已登录的鸭疫里默氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌的16S rDNA基因序列,设计了一对鸭疫里默氏菌16S rDNA基因的特异性引物190f和843r,分别以基因组DNA和菌落提取液为模板,从1~19型鸭疫里默氏菌参考菌株和代表亚型、变异株和可能新型的国内分离株共26株细菌中均扩增出大小为654bp的特异性片段,而扩增鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌和禽多杀性巴氏杆菌等感染鸭的常见细菌的结果均呈阴性。分别将鸭疫里默氏菌基因组DNA和菌落提取液进行10倍梯度稀释,基因组DNA的最小检出量为50pg,菌落最小检出量为15CFU/mL。结果说明,该PCR法具有较好的特异性和敏感性,可用于快速鉴定鸭疫里默氏菌。     

野猪瘁死症病原的分离鉴定

采集病死野猪的脾脏和血清,用特异抗猪瘟病毒抗体进行琼脂扩散试验检测发现有明显的沉淀线出现,证明野猪感染了猪瘟病毒,猪的致病性实验表明并非猪瘟强毒感染。采集病死野猪的心、肝、脾、肺、心血,经镜检、细菌分离培养、纯培养、生化试验和细菌G C mol%含量测定等检验,证实致病细菌有多杀巴氏杆菌,其G C mol%含量为39.7。毒力测试发现巴氏杆菌具有较强的致病性,LD50=10-1.57/0.5 ml。化脓放线杆菌的分离和毒力表明,化脓放线杆菌也参与致病作用。由此推测本次致死野猪的病原体为多杀巴氏杆菌并发或继发猪瘟病毒、化脓放线杆菌的三重感染所致。纸片扩散法(K-B法)药敏试验表明,两株细菌对头孢哌酮、头孢唑啉、丁胺卡拉霉素等高度敏感,为临床治疗和有效预防该瘁死症奠定基础。     

海南岛中南部热带雨林杀秀丽隐杆线虫Bt菌株筛选

植物寄生线虫对全世界的农作物造成了严重破坏并且难以防治,迫切需要开发高效并对环境友好的生物防治策略.本研究从海南中南部的尖峰岭、五指山、大里山、鹦哥岭热带雨林共采集1613份土壤样品,筛选分离出芽孢杆菌4399份,鉴定出Bt分离株224株,Bt菌株的分离率为5.09％.以模式生物秀丽隐杆线虫作为生物测定的靶标,筛选鉴定6株Bt菌株芽孢期蛋白对秀丽隐杆线虫有较好的杀虫活性.本研究在国内是首次对海南岛热带雨林杀线虫细菌资源进行调查,获得的杀线虫Bt菌株将来有可能进一步应用于植物线虫的生物防治.     

禽巴氏杆菌C48-3株成熟黏附蛋白基因cpm39的克隆及序列分析

目的：对禽巴氏杆菌C48-3躺株编码成熟黏附蛋白的基因cpm39进行克隆和序列分析。方法：通过PCR从禽巴氏杆菌C448-3。基因组DNA中扩增出cpm39基因,克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5d,并对目的基因进行核苷酸序列测定;用Clustal X和Mega 2．1软件将测定的序列与GenBank中已登录的16种血清型巴氏杆菌株核苷酸序列进行同源性分析。结果：测序结果表明cpm39基因大小为1002bp,与已知的16个血清型巴氏杆菌cpm39基因核苷酸序列的同源性为81．5％～100％。结论：克隆得到禽巴氏杆菌C。躺株编码成熟黏附蛋白的cpm39基因,该基因在不同血清型巴氏杆菌中具有很高的同源性,该蛋白可以作为研制预防巴氏杆菌病亚单位疫苗的候选抗原。     

兔多杀性巴氏杆菌C51-3株黏附蛋白的表达、纯化及其抗原性检测

应用PCR从兔多杀性巴氏杆菌C51-3株基因组DNA中扩增出编码36 kD黏附蛋白的cp36基因, 将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。以重组质粒pMD18-cp36为模板, 用PCR扩增得到编码信号肽除外的成熟黏附蛋白基因cpm36, 并克隆到原核表达质粒pQE30中, 得到重组质粒pQE30-cpm36, 转化大肠杆菌M15, 在IPTG诱导下表达融合蛋白CPM36, 经Ni2+-NTA亲和层析纯化。DNA测序结果表明cp36基因片段大小为1032 bp, 与已报道的16个血清型多杀性巴氏杆菌cp36基因的核苷酸序列比较, 同源性在76.9%~100%之间。SDS-PAGE结果显示, 表达分子量约为37 kD的带有6×His标签的CPM36蛋白, 与预期分子量相符。Western blotting结果表明, 抗重组蛋白抗体分别能与CPM36蛋白和多杀性巴氏杆菌36 kD蛋白发生特异性反应, 证明原核表达蛋白具有抗原性, 为进一步开展多杀性巴氏杆菌免疫保护性抗原的研究奠定了基础。     

巴氏甲烷八叠球菌BTC菌株的鉴定

本文报告了巴氏甲烷八叠妹菌BTC菌株的鉴定结果。该菌株在生活周期内均呈大小不等的团块聚集,8个不规则的球形细胞聚集在一起是团块构成的基本单位,未见单细胞阶段。在紫外线照射下,菌落荧光为蓝绿色,菌体荧光为蓝白色,活细胞或干制标本均可发出荧光。在以甲醇为生长基质时,其倍增时间为9．85h。可以利用甲醇,乙酸钠、三甲胺及H2／CO：为碳源;不能利用甲酸、乙醇、丙醇和丁醇等。最适生长pH为7．0。DNA的G+c mol％含量为41.5％。该菌株与巴氏甲烷八叠球菌近似或相同,而与马氏甲烷八叠球菌不同。其倍增时间较巴氏甲烷八叠球菌227菌株短,DNA中G+C mol％含量也与巳报道过的各菌株有 所差别,所以定名为巴氏甲烷八叠球曲BTC菌株(Methanosarcina barketi BTC)。