大鼠CRIP2蛋白的表达和分离纯化

目的:获得大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌中表达、纯化大鼠CRIP2(cysteine-rich intestinal protein 2)蛋白。方法:从大鼠主动脉组织中提取总DNA,RT-PCR扩增出相应大小的crip2 DNA片段,与pGEM-T-easy载体连接后测序;将测序正确的crip2按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白,通过镍柱进行纯化。结果:PCR获得的crip2序列与GenBank报道的一致(为707 bp);重组融合蛋白在大肠杆菌BL21中以可溶形式高效表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,在相对分子质量为27×103处有特异的蛋白条带,经镍柱纯化后,得到了高纯度的CRIP2融合蛋白。结论:克隆了大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌BL21中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度的CRIP2融合蛋白。     

小鼠附睾分泌的防御素Defb48的原核表达及纯化

目的:获取小鼠附睾分泌的防御素Defb48的基因并原核表达、纯化,为研究其功能奠定基础。方法:提取小鼠附睾组织的总RNA,用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的Defb48编码序列,将2段Defb48编码序列串联克隆至原核表达载体pET28(a)中,经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白;用镍柱进行重组蛋白的纯化,然后进行SDS-PAGE和Western印迹分析鉴定。结果:获得实验所需小鼠附睾分泌的防御素Defb48的基因序列,测序结果与已发表的基因序列一致;在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达了His-Defb48融合蛋白,经Western印迹分析,在相对分子质量18 000处有特异的蛋白条带,镍柱纯化后获得纯度较好的融合蛋白。结论:克隆了小鼠附睾分泌的防御素Defb48基因,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达纯化出融合蛋白,为制备其多克隆抗体,进而进一步研究Defb48的功能奠定了基础。     

大鼠热休克蛋白70的融合表达及纯化鉴定

目的：在大肠杆菌中高效表达并纯化大鼠热休克蛋白（HSP）70与麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白,以进一步研究细胞外HSfr70的生物学功能。方法：用RT-PCR方法扩增目的基因,并将其克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序;将该重组表达载体转化大肠杆菌B121,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达,建立最佳诱导表达条件;采用Amylose树脂预装柱对目的蛋白进行亲和纯化,并对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果：克隆出目的基因,构建了融合表达载体pMAL-c2X／hsp70;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明获得了目的条带,并纯化出纯度较高的融合蛋白;免疫印迹鉴定表明其具有抗原活性。结论：在大肠杆菌中高效表达并纯化了融合蛋白MBP-HSP70,为进一步研究细胞外HSP70的生物学效应提供了有用的材料。     

人呼吸道合胞病毒融合蛋白(F)片段原核表达、纯化和鉴定

目的克隆并表达人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株的融合蛋白(F)基因片段。方法利用PCR技术扩增HRSV兰州株的融合蛋白基因片段,克隆于原核表达载体pET-42b(+),转化大肠杆菌(Rosetta),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western-blot分析重组蛋白的表达及其反应原性。结果 PCR扩增得到951 bp的DNA片段,重组质粒pET42b-F经酶切鉴定和测序分析,表明质粒构建正确。表达的重组蛋白的相对分子质量为68 710,表达的重组蛋白占总菌体蛋白的7%,纯化后蛋白纯度达80%。经Western-blot分析,重组蛋白与抗RSV的单抗呈专一性强阳性反应。结论成功构建了HRSV兰州株F基因片段原核表达载体,并在大肠杆菌Rosetta中获得了表达,表达的重组蛋白具有反应原性和特异性,为HRSV感染引起的疾病血清学诊断以及试剂盒的研发提供了材料。     

羊口疮病毒蛋白ORFV035的表达、纯化和多克隆抗体的制备

克隆表达羊口疮病毒蛋白ORFV035,并制备其多克隆抗体,为后续对病毒复制、装配、形态发生和成熟过程的研究奠定基础。PCR扩增羊口疮病毒ORFV035基因,将其与质粒pET-30a(+)经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET30a-035。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化感受态大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。表达产物进行超声破碎和Ni柱纯化,纯化后目的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体并对其进行鉴定。成功构建了重组质粒pET30a-035,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达。包涵体洗涤、溶解后进行Ni柱纯化,得到纯度较高的ORFV035-his融合蛋白。以纯化蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体。Western blot检测显示该多抗可以识别天然ORFV035蛋白。成功诱导表达、纯化ORFV035蛋白并制备ORFV035多克隆抗体。     

重组人核因子κB亚基p65在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

将扩增得到的核因子（NF）κB亚基p65基因片段克隆至测序载体pGEM-T,测序验证该序列为预期目的片段后,再将该基因片段克隆至表达载体pGEX-4T2中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,用GST蛋白亲和柱纯化融合蛋白p65／GST。Western印迹验证该蛋白具有NF—κB抗原活性。结果表明,构建了NF—κBp65／GST融合表达载体,并表达和纯化了NF—κBp65／GST融合蛋白,为进一步研究NF-κB的功能和筛选NF—κB拮抗分子奠定了基础。     

果蝇odd蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能,根据已报道的odd基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增,将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体;重组子经酶切测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体活性。结果表明,获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体,为后续的odd功能研究奠定了基础。     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

小鼠睾丸特异性基因Vad1.2重组蛋白的构建及多克隆抗体制备

目的：构建小鼠睾丸特异性基因Vad1.2重组蛋白,制备多克隆抗体。方法：将小鼠睾丸组织Vad1.2转录本行RT-PCR扩增,通过DNA重组技术插入克隆载体p ET15b,进行酶切及DNA序列分析。将表达载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）RIL感受态细胞,10 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白,通过10%SDS-PAGE、Western blotting及质谱分析进行鉴定。随后对重组Vad1.2蛋白进行纯化和进一步鉴定。最后,制备兔抗小鼠Vad1.2多克隆抗体,并通过Vad1.2-EGFP质粒转染GC-2spd（ts）细胞对其特异性进行验证。结果：大肠杆菌BL21（DE3）RIL细胞中诱导表达并纯化的小鼠Vad1.2重组蛋白构建正确并经Western blotting和质谱分析得到证实。所制备的多克隆抗体可特异性识别GC-2spd（ts）细胞中过表达的Vad1.2-EGFP融合蛋白。结论：成功构建小鼠Vad1.2重组蛋白,并制备多克隆抗体,为Vad1.2基因的进一步研究奠定了实验基础。     

恶性疟P190抗原基因的表达及免疫学研究

克隆了我国海南省FCCl／HN株P190抗原三肽重复区基因,定名为P190TR。该基因片段经DNA序列分析鉴定后连接到改建的pGEx一2T表达载体BamHⅠ和xbaⅠ位点中,经鉴定的重组质粒转化感受态JM109(DE3)大肠杆菌进行表达。结果显示：该基因得到高效融合表达．经一步亲和纯化后就取得高纯度的重组蛋白。用纯化的表达蛋白免疫动物亦产生P190TR特异性抗体。     

小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1原核表达载体的构建及表达

目的:构建小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKXI原核表达载体并进行表达,以期得到大量的His标签融合蛋白.方法:根据GenBank中的TaCKXI序列以及pET-24a载体中的多克隆位点设计引物,以含有TaCKXl编码基因的批pMD-QRCKXI重组质粒为模板,经PCR扩增得到TaCKXI基因的DNA片段.将所得的片段与pET-24a载体连接,转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆,其测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pET-TaCKXI已构建成功.提取per-TaCKXI质粒转化到BL21(DE3)pLysS表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件.结果:在大肠杆菌中获得TaCKXI基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为58.91kD;IPTG终浓度为0.5、1.0、1.5.2.0mmol/L时,诱导融合蛋白产量相差不大.选用0.5mmol/L诱导15h获得大量的融合蛋白.经用原核表达蛋白纯化试剂盒纯化,得到了单一的融合蛋白.结论:小麦TaCKXI基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后TaCKXI蛋白多克隆抗体的制备奠定了基础.     

人颗粒裂解肽片段在大肠杆菌中的表达

目的：建立颗粒裂解肽（NKG5）的原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法：采用寡核苷酸合成、PCR扩增得到NKG5编码序列,克隆到pGEM-T载体上,经测序正确后,再切下编码序列连接到重组表达载体pGEx-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组工程菌表达,采用谷胱甘肽偶联的Sepharose 4B纯化重组蛋白。结果：重组菌株可以表达GST-NKG5融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量34000处有一条带。结论：获得了在大肠杆菌中低表达的颗粒裂解肽融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1及其突变体的原核表达

目的:构建鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)及其突变体(NSP1 mu)的原核重组表达质粒,在大肠杆菌中分别融合表达重组NSP1及NSP1 mu。方法:以现有质粒载体为模板,扩增编码NSP1及NSP1 mu的基因片段,并克隆至pMD18-T克隆载体;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析;将阳性克隆的目的片段亚克隆至表达载体pET-28a,并转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并加入IPTG诱导表达,SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达。结果:PCR扩增得到表达NSP1及NSP1 mu的特异片段,并克隆到pMD18-T载体,测序结果正确无误;构建了NSP1和NSP1 mu的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中分别融合表达了重组NSP1及NSP1 mu,表达的目的蛋白均能与His单克隆抗体特异结合;用Ni-NTA琼脂糖试剂盒纯化重组蛋白,获得可溶性的NSP1及NSP1 mu,相对分子质量分别为27×103和28×103。结论:在大肠杆菌中分别表达并纯化获得了大量可溶性重组NSP1及NSP1 mu。     

GST—talinl融合蛋白的原核表达及纯化

应用PCR方法扩增talinl的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX-4T-1中,获取人源的GST—talinl融合蛋白,为下阶段深入的研究talinl的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定．选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B柱纯化,western blot鉴定。克隆得到了一个2400bp的talinl的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为121、6kD的融合蛋白。用基因工程方法使GST—talinl重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST—talinl融合蛋白。     

酿酒酵母乙醇脱氢酶2(ADH2)基因的克隆表达及活性验证

为了从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆出乙醇脱氢酶2(Alcoholdehy drogenase2,ADH2)基因并使之在大肠杆菌中高效表达。以酿酒酵母细胞中提取的总RNA为模板,通过反转录获得酿酒酵母乙醇脱氢酶2基因,连接到表达载体pTAT上,得到重组表达质粒pTAT-ADH2,将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,重组工程菌株经IPTG诱导表达得到ADH2蛋白。将该蛋白纯化后,在体外进行活性检测和小鼠体内进行毒理试验,检测ADH2的酶活性。测序结果表明克隆的基因与GenBank中所报道的adh2基因序列有90%的同源性,经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白得到了有效表达,蛋白条带扫描分析表明,表达量占总蛋白的50%左右,纯化得到的蛋白在小鼠体内进行毒理试验,显示出一定的活性。酿酒酵母adh2基因的克隆正确,不仅在大肠杆菌中进行了高效表达而且表现出了较好的酶活性。     

鸡氨肽酶N的高效可溶性表达及生物学功能分析

本研究旨为克隆鸡氨肽酶N(chAPN)基因,高效表达可溶性目的蛋白,并测定其生物学功能。应用RT-PCR方法从鸡胚肾细胞中克隆chAPN的基因片段,经测序鉴定后再克隆至原核表达载体pCOLD-TF,构建重组原核表达质粒pCOLD-TF-chAPN,在大肠杆菌BL21(DE3)中经不同条件诱导表达目的蛋白;利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定;Leu-PNA酶促反应和ELISA等方法检测目的蛋白生物学功能。结果显示,重组质粒pCOLD-TF-chAPN在大肠杆菌中以可溶形式高效表达;酶促反应及ELISA结果显示该蛋白具有酶活性,可结合传染性支气管炎病毒(IBV),并表现为剂量依赖性。这为今后研究chAPN的酶活性、作为IBV受体及抗病毒功能奠定了实验基础。     

AA12(LG21)可溶性表达研究及抗体制备

用PCR技术从AA22基因上扩增出LG21(100—498bp)片段,并克隆到原核表达载体pET—28a( )上;转化大肠杆菌B121(DE3),进行诱导表达研究,使其在大肠杆菌中能够可溶性表达,优化表达条件获得表达量比较高的LG21蛋白;用镍离子螯和柱(Ni—NTA)纯化LG21蛋白,获得纯度较高的蛋白。用纯蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA结果显示效价可达到1：163 840;Westem结果表明该抗体可以与LG21蛋白特异结合;为进行免疫共沉淀实验,验证Chkl蛋白与AAl2蛋白在体内的相互作用奠定了基础。     

具有免疫反应性的猪瘟病毒多表位基因在大肠杆菌中的克隆表达和鉴定

将猪瘟病毒不同抗原表位基因串联构成重组基因BT21,化学合成后克隆至pMD18-T载体中,然后再将BT21串联基因片段插入原核表达载体pGEX-6P-1。经酶切和测序鉴定后,构建的重组质粒pGEX—BT21转化大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE分析,用G1utathione Se-pharose4B亲和层析法纯化目的蛋白和Western blot分析其免疫学活性。结果表明：融合蛋白GST—BT21以可溶形式表达,分子量约为33kDa,与预期大小相符,纯化的重组蛋白可被猪瘟病毒阳性血清所识别,具有良好的免疫学活性。从而为进一步研究该融合蛋白的免疫特性和功能奠定了基础。     

GST-His双标签原核表达载体的构建及应用

目的：在原有带有GST标签的pGEX-KG载体上添加His标签,构建双标签原核表达载体,以提高纯化后的融合蛋白的纯度。方法：双酶切pGEX-KG载体,将同样带有双酶切位点编码His标签的DNA序列酶切后与其连接、转化大肠杆菌DH5α、鉴定阳性克隆并测序,并将编码雌激素受体B（ERβ）的片段构建到该载体上,分别利用GST标签和His标签对ERβ蛋白进行2次纯化。结果：构建了GST-His双标签原核表达载体,将ERβ编码片段克隆入该载体中,在原核生物中得到表达;分别用GST和His抗体进行Westernblot分析,均可检测到GST-His-ERβ融合蛋白的表达;利用此双标签载体纯化得到了纯度较高的ERβ蛋白。结论：GST-His双标签原核表达载体的构建对提高目的蛋白纯度具有重要意义。     

果蝇心脏发育标记基因Hand多克隆抗体的制备

制备果蝇心脏标记基因Hand抗体对研究果蝇心脏发育具有重要意义。从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板PCR得到Hand基因部分片段,将片段连接到pET-28a上,构建重组质粒pET一28a—Hand,将重组质粒转化rosetta受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化,SDS—PAGE电泳分析,结果表明Hand基因在大肠杆菌中成功表达,表达的Hand融合蛋白分子量大约为24kD,经镍柱纯化后获得了高纯度可溶性的Hand蛋白。