Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

Sp1基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建干扰载体pSilencer3.1-Sp1,并初步研究其对Sp1基因的干扰作用。方法：根据Sp1cDNA编码序列,设计并合成针对Sp1基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer3.1-H1neo干扰载体中,构建Sp1基因小干扰RNA（siRNA）真核表达载体pSilencer3.1-Sp1;分别将阴性对照载体pSilencer3.1与重组载体pSilencer3.1-Sp1经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Sp1基因的转录与表达水平。结果：构建了Sp1基因siRNA真核表达载体pSilencer3.1-Sp1,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果。结论：特异性siRNA能明显抑制Sp1基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Sp1的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

CDC6靶向RNA干扰质粒载体的构建及生物活性鉴定

目的:构建小鼠CDC6基因的RNAi真核表达载体PGCsilencer TM u6/Neo/GFP/RNAi,观察其转染小鼠肝细胞前后CDC6的表达变化。方法:根据GenBank中CDC6的序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至PGCsilencer U6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至正常小鼠肝细胞中,用RT-PCR检测CDC6的mRNA的表达及用Western blot方法检测CDC6蛋白水平的表达,并比较转染前后其表达水平的变化。结果:经测序,模板序列与设计序列完全正确,经过RT-PCR及Western blot方法检测,转染干扰质粒后,小鼠肝细胞中CDC6表达在mRNA及蛋白水平都有明显的下降。结论:成功构建了CDC6基因的RNAi真核表达载体并转染至小鼠肝细胞中,为下一步探讨CDC6在肝再生的作用奠定了基础。     

大鼠晚期糖基化终产物受体基因特异性小干扰RNA表达载体的构建及其活性鉴定

应用两个RNA干扰实验技术网络的RNA设计软件,模拟SD大鼠晚期糖基化终产物受体(RAGE) mRNA的二级结构,设计针对RAGE mRNA417、221和534位点的3对小干扰RNA(siRNA)序列(21nt),再转化为能表达其小发夹结构RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,分别将其克隆于pGCsi-U6/Neo/GFP载体,利用酶切和序列分析鉴定克隆的正确性。将RAGE特异性siRNA表达克隆转染肝星状细胞(HSC)-T6细胞系,以空白及转染非特异性siRNA表达克隆作为对照,分别以实时荧光定量PCR和Western印迹法检测各组HSC-T6细胞RAGE基因和蛋白质的表达。结果显示:成功构建了RAGE特异性siRNA重组表达载体pGCsi-R1、pGCsi-R2、pGCsi-R3和非特异性siRNA重组表达载体pGCsi-C,与对照组相比,转染特异性siRNA重组表达载体的HSC-T6细胞的RAGE mRNA表达受到明显抑制,在0.25～1.0nmol/L范围内,RAGE mRNA下调幅度呈浓度依赖性增加,以1.0nmol/LpGCsi-R1最显著,转染pGCsi-C的HSC-T6细胞的RAGE mRNA表达水平无明显变化。转染pGCsi-R1的HSC-T6细胞24、48和72h表达的RAGE mRNA分别较空白对照组下调(79.65±8.88)%、(78.96±7.94)%和(73.11±6.89)%(F=71.397,61.824,61.98,P均<0.01),在72h范围内,RAGE mRNA下调幅度呈时间依赖性降低。同时,转染pGCsi-R1的HSC-T6细胞50kDa和46kDa的RAGE、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA及蛋白质的表达也明显下调,分别为空白对照组的(43.91±1.18)%(F=386.19,P<0.01)、(36.33±0.78)%(F=386.07,P<0.01)、(57.53±3.25)%(F=20.91,P<0.05)和(58.48±3.08)%(F=56.59,P<0.05)。结果表明:pGCsi-R1表达的特异性siRNA可高效抑制HSC-T6细胞中RAGE基因和蛋白质的表达及肝星状细胞的激活。     

针对多效蛋白基因的小干扰RNA的设计及其稳定表达载体的构建

目的:设计多效蛋白基因特异性的小干扰RNA(siRNA),并构建一系列能在哺乳动物细胞内稳定表达这些siRNA的表达质粒,以便为在体外研究多效蛋白基因的功能打下基础。方法:设计并合成具有多效蛋白基因特异性的一组寡核苷酸片段,并克隆到pSilencer3.1-H1hygro载体;用脂质体LipofectAMINE2000转染和潮霉素筛选等方法建立能稳定表达相应siRNA的一组Pten-/-细胞克隆;利用Northern印迹检测这些细胞内多效蛋白基因的表达情况。结果:设计并构建了3个针对多效蛋白基因的siRNA表达质粒,并证明其中的1种质粒能在Pten-/-细胞内稳定表达相应的siRNA,并显著地抑制了该细胞多效蛋白基因的表达。结论:设计并构建出的针对多效蛋白基因的siRNA表达载体所表达的siRNA具有较强的RNA干涉功能,为多效蛋白基因的功能研究奠定了实验基础。     

人eya2基因小干扰RNA表达载体的构建及表达

目的：设计并构建人eya2（eyes absent2）基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人eya2为靶基因,以pSliencer2．1-U6 neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5Ⅸ菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Westemblot和转录活性实验检测其抑制效果。结果：重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Westemblot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论：构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。     

特异小干扰RNA敲除PLK1基因的表达

为研究特异小干扰RNA（siRNA）作用于大肠癌细胞株SW480中PLK1 (Polo-like kinase 1)基因表达的mRNA对该细胞分裂生长的影响,设计了对应于PLK1基因表达mRNA不同位点的10种特异siRNA,经化学合成后,用脂质体转染SW480细胞,实时定量PCR检测PLK1基因的表达,观察不同的siRNA作用强度,并计数细胞了解相应细胞的生长情况,western-blot观察PLK1表达蛋白的变化和流式细胞计数分析细胞周期改变。发现10种siRNA均可敲除PLK1基因表达的20 %以上,其中P1、P4和P9 3组敲除mRNA达80 ％以上,这3种siRNA及其混合物对PLK1基因mRNA的作用具有相应浓度效应,在25 nmol/L时达到最佳作用效果,而且相同浓度的混合物作用效果更好（超过95%）,PLK1表达蛋白质明显降低,细胞周期在G2期受到阻碍。72 h后的各种siRNA浓度下细胞生长变化与PLK1基因的mRNA水平变化相一致。结果表明化学合成的特异siRNA对SW480细胞中PLK1基因表达具有消除作用,混合物作用更强,在细胞水平上抑制了SW480细胞的分裂生长。     

利用小干扰RNA降低新基因CCP22的表达水平

目的:构建针对新基因CCP22的小干扰RNA(siRNA),降低CCP22蛋白表达水平。方法:设计一条针对新基因CCP22的siRNA序列,克隆到siRNA表达载体pSilencer-2.1-U6-neo上,测序验证正确后,将此表达载体与重组Flag-CCP22的表达载体pcDNA3.0-FLAG-CCP22共转染HEK293T细胞系,或单独转染CCP22siRNA,用West-ern印迹检验构建的CCP22siRNA的效果。结果:构建了针对新基因CCP22的siRNA,Western印迹结果表明CCP22siRNA序列能有效降低外源和内源CCP22蛋白的表达水平。结论:构建的CCP22siRNA干扰效果好,为进一步研究CCP22的功能奠定了基础。     

针对小鼠早期生长反应因子-1发夹结构小干扰RNA载体的构建及其干扰效率鉴定

目的:构建及筛选高效率针对早期生长反应基因-1(Egr-1)进行RNA干扰(RNAi)的质粒.方法:根据Egr-1基因mRNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空栽体pGCSIL-GFP中,构建重组质粒,同时设计构建不针对任何特异基因的质粒作为阴性时照.将shRNA袁达质粒转粢HEK293细胞.通过对GFP表达量的观察,荧光定量PCR及western blotting定量检测Egr-1基因的表达,鉴定shRNA表达质粒对Egr-1的干扰效率.结果:针对小鼠Egr-1基因进行RNAi的3个序列中,有1个序列的干扰效率大于70%以上.结论:成功构建了1个针对小鼠Egr-1基因的高效RNAi表达质粒.     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率。方法合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSileneer载体．构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体。将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT—PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平。结果酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT—PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43．6％、47．7％和81．6％,它们的干扰效果被Western印迹所证实。结论干扰率为81．6％的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,。岜可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究。     

角鲨烯合成酶特异性mU6-siRNA真核表达载体的构建及鉴定

利用RNA干扰技术靶向构建角鲨烯合成酶基因ERG9特异性真核表达载体。将针对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Linder)ERG9不同部位所设计的3对siRNA序列通过重组技术克隆到质粒mU6 pro中构建真核表达重组体mU6 ERG9 siRNA1、2、3,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过限制性酶切和测序分析对重组表达载体进行鉴定,分析结果表明3个表达载体的设计基因插入正确,成功构建了ERG9特异性真核表达载体mU6 ERG9 siRNA,重组体的成功构建为在裂殖酵母细胞中靶向RNA干扰角鲨烯的合成从而提高辅酶Q10合成途径的代谢通量打下基础。     

小分子G蛋白Rapl shRNA表达载体的构建和鉴定

应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制Rapl基因的表达,构建Rap1 shRNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体,观察其对小鼠肝脏细胞中Rap1 mRNA和蛋白表达的干扰作用.根据小鼠Rap1 mRNA的全序列.设计了3种Rap1 siRNA序列(Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3)和阴性对照序列(HK);采用克隆技术,将其插入带有报告基因绿色荧光(ECFP)的pGenesil-3栽体,构建Rap1 shRNA表达载体:经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;昆明小鼠40只,体重18～20 g,随机分成4组: Ⅰ组(转染HK组)、Ⅱ组(转染Rapl shRNAl组)、Ⅲ组(转染Rap1 shRNA2组)、Ⅳ组(转染Rapl shRNA3组).于0、16、24 h腹腔内注射Rapl shRNA 2.0～2.5 mg/kg(用PBS稀释至1 mL);48 h后收集小鼠肝脏.用显微荧光、定量RT-PCT、免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1shRNA的转染率、Rap1基因表达以及蛋白质表达水平.Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60%,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的Rap1 mRNA表达、Rap1蛋白表达均降低,其中Rap1 shRNA1干扰效果最佳.     

大鼠Otos基因RNA干扰质粒体的构建

目的:构建其基因Otos的RNA干扰质粒载体,为研究Otospiralin在内耳的生理功能奠定基础。方法:在GenBank中查到大鼠Otos基因的序列,输入到相应的设计软件中,以此设计引物序列,经过PCR扩增,酶切后,克隆于pAVU6 27载体并行酶切鉴定。结果:构建的鼠Otos shRNA载体经过测序鉴定,所得和预期相符。结论:重组质粒pAVU6 27-Otos的成功构建为下一步研究打下良好的基础。     

猪肌肉生长抑制素RNA干涉载体的构建与验证

目的:构建针对猪肌肉生长抑制素mRNA的RNA干涉载体,并体内验证其有效性。方法:分别体外转染化学合成4个19 bp的siRNA片段获取针对肌肉生长抑制素的序列,构建RNA干涉载体,将上述载体注射到猪股四头肌中,RT-PCR检测证明其表达有效性及生肌调节因子mRNA水平的变化。结果:获得了针对肌肉生长抑制素的2个小干涉RNA序列,构建了2个重组载体,股四头肌注射混合后的等量重组载体,RT-PCR显示注射重组RNA干涉载体可显著降低肌肉生长抑制素的mRNA水平(约降低了40%),生肌调节因子mRNA水平显著上调(分别约为对照组的2.1～3.9倍)。结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础。     

KLF4siRNA慢病毒载体构建和鉴定

目的:构建上皮锌指蛋白4(Krüppel-like factor 4,KLF4)siRNA慢病毒载体并进行初步鉴定,为研究KLF4在宫颈细胞癌中的分子机制奠定基础。方法:利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则,设计4个RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的单链DNA oligo,然后退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证,测序结果经比对确认正确的克隆,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。收集上清液感染宫颈癌He La细胞,通过q RT-PCR及Western Blot鉴定KLF4 siRNA慢病毒干扰效果。结果:成功构建KLF4 siRNA慢病毒载体。KLF4 siRNA慢病毒感染He La细胞后,q RT-PCR及Western Blot测定结果显示,KLF4表达明显降低。结论:KLF4 siRNA慢病毒载体构建及包装成功,可有效抑制KLF4表达,为研究KLF4生物学功能奠定基础。     

骨骼肌特异表达载体的构建与验证

目的:构建肌肉特异性表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶的肌肉特异性载体,证明其表达的有效性.方法:化学合成292bp的带有肌肉特异性转录因子结合位点的DNA序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1 - SF,4w龄C57BL/6小鼠肌肉注射该重组载体,RT - PCR检测证明其表达有效性.结果:DNA测序结果证明合成的292 bp片段带有肌肉特异性表达元件;PCR鉴定显示启动子片段正确地插入到目的基因上游;RT - PCR鉴定显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录.结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础.     

转录因子Twist的siRNA筛选、腺病毒构建及功能检测

目的 筛选特异性沉默人的Twist基因的siRNA序列,构建siTwist腺病毒并在MG63及143B骨肉瘤细胞中进行功能鉴定.方法 体外退火获得4组siTwist双链DNA序列,克隆至含有Twist基因的pSOS-Twist质粒中获得pSOS-siTwist质粒,脂质体转染HEK293细胞,GFP检测筛选有功能的siTwist片段,将筛选出的siTwist序列构建腺病毒,感染143B骨肉瘤细胞.通过RT-PCR、Western 印迹检测Twist的表达.siTwist与Twist腺病毒共感染MG63骨肉瘤细胞,细胞计数及细胞侵袭实验检测siTwist对Twist的抑制作用.结果 在HEK293细胞中,4组siTwist中有2组GFP的表达明显降低,且siTwist腺病毒能抑制143B骨肉瘤细胞中内源性的Twist表达,Twist腺病毒能促进MG63骨肉瘤细胞的增殖和转移,而两组siTwist与Twist共感染组MG63细胞的增殖及迁徙率均明显低于Twist组（P〈0.05）.结论 筛选出两对特异性沉默Twist基因的siRNA片段,并成功构建腺病毒,转染细胞后能有效抑制内源性和外源性的Twist表达,为研究Twist在骨肉瘤细胞增殖和转移中的作用及具体机制提供了有效的分子工具.     

人促红细胞生成素鸡输卵管特异表达载体的构建

通过PCR技术从产蛋鸡输卵管基因组中扩增出1.1kb的鸡卵清蛋白5'端调控区,将其亚克隆人pMD18-T载体的多克隆位点）命名为pOV),经酶切和测序鉴定可作为调控序列来启动外源基因的表达。然后从pOV上切下卵清蛋白5'端调控区,再将其亚克隆入pBCE经SaⅡ和HindⅢ双酶切的切口处,酶切鉴定为正向插入,成功构建了鸡卵清蛋白5'端调控区调控人促红细胞生成素的质粒表达载体pOV-hEPO,为制备生产人促红细胞生成素的鸡输卵管生物反应奠定了基础。     

高效缺氧诱导表达载体的构建与鉴定

目的：构建缺氧诱导表达载体,以介导报告基因在缺氧环境下的特异、高效表达。方法：通过分子生物学方法,将鼠磷酸甘油酸激酶基因的缺氧应答元件（HRE）和最小CMV（mCMV）启动子重组,构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）或萤光素酶报告基因的可诱导载体;通过酶切鉴定和测序分析,证实载体获得正确的构建;将重组载体转染HeLa细胞,观察EGFP荧光强度并检测萤光素酶活性。结果：HRE／mCMV启动子调控的报告基因载体具有特异和高效的诱导活性。结论：构建了可以进行特异和高效缺氧诱导的报告基因载体,为其进一步的开发和应用奠定了实验基础。