微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用的鉴定

为鉴定微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1在肝脏组织的功能,采用GST pull-down结合质 谱技术,检测该蛋白在肝脏中的结合蛋白,结果提示,肌球蛋白Ⅵ与HSPC300/hHBRK1共沉降,Western 印迹杂交证实了质谱的结果．构建HSPC300/hHBRK1原核表达载体,诱导并获得了His-hHBRK1融合蛋白．利用免疫共沉淀证实hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ存在相互作用,激光共聚焦检测显示hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ在肺癌95D细胞的胞浆共定位,提示其相互作用可能是直接结合．肌球蛋白Ⅵ参与细胞迁移、高尔基分泌泡的运输和维持高尔基体稳定性等作用．hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用,为微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1参与细胞迁移和胞内物质运输提供了进一步佐证．     

miR-223在结肠癌组织中的表达及促进结肠癌细胞迁移侵袭的机制研究

目的:探讨微小RNA-223 (mi R-223)在结肠癌组织中的表达及对结肠癌HT-29细胞侵袭、迁移能力的影响及机制。方法:检测mi R-223在结肠癌组织与癌旁组织中的表达。通过脂质体转染法将mi R-223模拟物(mi R-223 mimics,mi R-223 mimics组)及microRNA无关序列(mi R-223 NC,NC组)转染入结肠癌HT-29细胞。采用Real-time PCR检测转染后细胞中mi R-223和TWIST的表达,Western blot检测TWIST的蛋白表达,Tranwell检测细胞的迁移与侵袭能力。双荧光素酶报告基因检测mi R-223对TWIST基因启动子活性的影响。采用Transwell迁移与侵袭实验检测mi R-223 mimic及Twist si RNA共转染后人结肠癌细胞系HT-29迁移与侵袭能力的变化。结果:与癌旁结肠组织比较,mi R-223在结肠癌组织中呈现明显高表达(P0.05);与空白对照组和mi R-223 NC组比较,转染mi R-223 mimics后的HT-29细胞中的mi R-223表达显著增加(P0.05)。与阴性对照组和空载转染组相比较,mi R-223 mimics转染组穿透的细胞数目明显增加(P0.05),且mi R-223 mimics转染组的细胞侵袭能力显著增强(P0.05)。与mi R-223 NC组和空白对照组比较,转染mi R-223 mimics的HT-29细胞的TWIST基因m RNA和蛋白表达均显著增加(P0.05)。双荧光素酶检验结果显示TWIST为mi R-223的下游靶基因。共转染TWIST si RNA和mi R-223 mimics的结肠癌HT-29细胞的迁移与侵袭能力较单独转染mi R-223 mimics的HT-29细胞显著减弱(P0.05)。结论:mi R-223可能通过上调下游靶基因TWIST水平促进结肠癌HT-29细胞的迁移与侵袭。     

PD-L1蛋白过表达对HeLa细胞迁移能力的影响北大核心

[目的]探讨PD-L1过表达对HeLa细胞迁移的影响。[方法]通过分子克隆构建PD-L1质粒载体(p EGFPPD-L1);通过PEI法转染质粒,调节质粒转染量(1μg、3μg、5μg)和转染时间(24 h、36 h、48 h、72 h),优化转染条件;通过细胞划痕实验检测细胞融合率,Western Blot检测细胞迁移相关蛋白(E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白)的表达量。[结果]最佳转染条件是质粒量3μg/孔,转染后48 h观察,此时转染效率可达(82.94±8.08)%。转染pEGFP-PD-L1质粒后,HeLa细胞的PD-L1过表达3.5倍,划痕融合率显著增高(p<0.01);波形蛋白和N-钙黏蛋白的表达量显著升高(p<0.05),E-钙黏蛋白表达量显著下降(p<0.05)。[结论]PD-L1过表达显著促进HeLa细胞迁移能力和上皮向间质转化水平。     

芍药苷对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的观察芍药苷对人结肠癌SW480细胞株增殖、侵袭、迁移的影响,探究其干预机制。方法含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基常规培养人结肠癌SW480细胞株,CCK-8以及EdU-488法检测芍药苷对SW480细胞增殖的影响,Transwell小室检测芍药苷对SW480细胞侵袭、迁移的影响,Westernblot法检测beclin1、Bcl-2蛋白的表达。结果不同浓度芍药苷分别处理24h、48h、72h的结肠癌SW480细胞增殖活性受到显著抑制:相比较对照组,160μg/ml芍药苷处理48h后,SW480细胞内黄绿色荧光减弱,细胞增殖率显著下降,为(58.91±4.99)%;SW480细胞的侵袭细胞数、迁移细胞数显著下降:侵袭抑制率为26.50%,迁移抑制率为24.67%;beclin1蛋白表达高于对照组,Bcl-2蛋白表达低于对照组,beclin1与Bcl-2蛋白表达呈负相关。结论芍药苷能够抑制结肠癌SW480细胞增殖、侵袭和迁移,其机制可能通过抑制Bcl-2蛋白表达,上调beclin1蛋白的表达。     

朊蛋白在结肠癌及结肠炎组织中的表达及其临床意义

目的：观察朊蛋白（PrPc）在正常结肠粘膜、结肠炎及结肠癌组织中的表达,并探讨其临床意义。方法：采用免疫组织化学法分别检测PrPc在正常结肠组织、结肠炎及结肠癌组织（各40例）中的表达,并分析其在结肠癌及结肠炎组织中的表达与患者性别、分化程度、TNM分期、淋巴结转移及炎症程度等临床特征间的关系。结果：PrPc在正常结肠及结肠癌组织中均有表达,在结肠炎中表达较低,在结肠癌组织中阳性表达率为60％（24／40）,明显高于正常结肠组织的35％（14／40）及结肠炎组织的30％（12／40）（P〈0．05）。轻度结肠炎中PrPc的阳性表达率明显高于重度结肠炎,结肠癌中PrPc的表达与患者的肿瘤分级、分期显著相关（P〈0．05）。结论：PrPc在结肠癌中的表达增高,在结肠炎中表达较低,可作为临床判断结肠癌恶性程度及结肠炎炎症程度的重要参考指标。     

钙调蛋白结合蛋白及其磷酸化对癌细胞迁移能力的影响研究

轻链钙调蛋白结合蛋白(light-chain caldesmon,l-CaD)是一种肌动蛋白结合蛋白,它通过与肌动蛋白结合而稳定胞内微丝结构,在磷酸化作用下则能从微丝上脱离.在众多非转移性癌细胞以及永生化的正常细胞系中,l-CaD的表达量很低甚至没有,但在高迁移活性的转移性癌细胞中,l-CaD表达量显著上升,因此l-CaD可能是维持转移性癌细胞高迁移能力的重要因素.为了探索l-CaD如何调节转移性癌细胞迁移活性及其所处地位,以人源转移性乳腺癌细胞MDAMB-231作为载体,一方面,在胞内高表达外源野生型l-CaD及其磷酸化突变株,干扰胞内l-CaD的磷酸化进程,从而考察l-CaD磷酸化对细胞迁移的调节,另一方面,利用siRNA技术,抑制l-CaD在MDAMB-231细胞内的表达量,检测l-CaD对转移性癌细胞迁移活性的总体影响.通过细胞骨架荧光染色、细胞迁移小室、单细胞层次上的牵张力测定以及细胞基底脱黏附能力测定,结果显示:a.阻断MDAMB-231胞内l-CaD的磷酸化进程将显著抑制细胞的迁移能力,细胞骨架调整受阻,基底牵张力增加,细胞基底脱附能力下降;b.l-CaD表达抑制的MDAMB-231细胞失去了完...     

白介素10对人成熟树突状细胞蛋白表达的影响

利用人外周血淋巴细胞分离液密度梯度离心分离CD14~+的单核细胞,并通过IL-4、GM-CSF、LPS、IFN-γ等重组细胞因子在体外将其诱导为成熟树突状细胞(mature dendritic cells,mDCs),利用10 ng/mL白介素10 (interleukin-10,IL-10)处理mDCs 4 h,双向电泳联合MALDI-TOF/TOF MS技术分析差异表达蛋白。结果显示共筛选出35个差异蛋白点,其中21个上调,14个下调,它们的功能主要涉及糖代谢、HIF信号转导通路、细胞骨架和免疫功能等。因此,IL-10可能通过调控mDCs的代谢过程以及细胞骨架或运动能力等相关蛋白来影响其生物学功能,为进一步深入研究IL-10对mDCs的影响具有潜在作用。     

视黄醇结合蛋白4 对血管平滑肌细胞迁移和增殖的影响及机制

目的:研究视黄醇结合蛋白4(Retinol-binding protein 4,RBP4)对血管平滑肌细胞(SMCs)迁移和增殖的影响及分子机制。方法:体外培养大鼠主动脉SMCs,采用划痕实验及Boyden's迁移小室实验观察RBP4对SMCs迁移的影响,采用免疫印迹实验技术检测Akt的磷酸化水平,采用Boyden's小室实验观察PI3K抑制剂LY294002预处理细胞对RBP4促SMCs迁移的影响,应用MTT比色实验结合流式细胞仪技术,检测RBP4对SMCs细胞增殖及细胞周期的影响。结果:RBP4呈剂量依赖性诱导大鼠血管SMCs迁移(P0.05);RBP4处理细胞显著增加了Akt磷酸化;PI3K抑制剂LY294002预处理细胞则显著抑制了RBP4的促迁移作用(P0.05);RBP4处理有增加SMCs数量的趋势,且可轻微阻滞细胞进入S期,但未达到统计学显著性(P0.05)。结论:RBP4通过PI3K-Akt通路诱导大鼠血管SMCs迁移,对细胞增殖及细胞周期则无显著影响。     

PUMA在结肠癌细胞中的表达及诱导细胞凋亡中的作用

目的:通过5-Fu诱导携带有野生型p53基因的HCT116和携带有突变性p53基因的HT-29两种结肠癌细胞系,比较两株细胞在各时间点凋亡水平和PUMA mRNA表达情况的差异,探讨PUMA对细胞凋亡的作用及诱导其表达的基本途径。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测不同结肠癌细胞株HT-29、HCT116在抗肿瘤药物5-Fu作用下不同时间点结肠癌细胞株内PUMA mRNA表达水平的差异,用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)荧光染色检测各时间点细胞的凋亡水平,分析其与PUMAmRNA表达水平之间的关系。结果:携带有野生型P53基因的结肠癌细胞株HCT116在5-Fu作用下6h即可出现PUMA mRNA的表达,随着药物作用时间的延长其表达强度增加,并且与细胞凋亡水平呈正相关;含有突变型P53基因的结肠癌细胞株HT-29在5-Fu作用下无PUMA的表达。结论:通过5-Fu诱导细胞凋亡出现的PUMA表达需要野生型P53基因,突变型P53基因无法诱导PUMA的表达。PUMA与结肠癌细胞凋亡水平呈正相关,是一种促凋亡蛋白。     

HSP27对细胞迁移的调控

细胞迁移是多细胞生物的一项基本生理过程,不仅在血管重建、炎症反应、发育、伤口愈合等方面发挥重要作用,而且还与肿瘤细胞侵袭和转移有关.热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)是小型热休克蛋白家族中研究最广泛的成员之一,普遍存在于生物体内.HSP27是一种多功能蛋白质,可以通过黏着斑和肌动蛋白调节细胞迁移.另外,HSP27还可调控肿瘤早期的上皮间质转化,影响癌症转移.本文整理了近期关于HSP27参与细胞迁移及相应的肿瘤细胞转移方面的研究,探究HSP27在临床医学研究领域的价值和应用前景.     

人精子蛋白17放射诱导表达细胞模型的构建

目的:构建pEgr-Sp17重组质粒,并检测其在人卵巢癌细胞系HO8910中的辐射诱导表达,探索Egr-1基因调控序列辐射诱导下游基因表达的功能,建立放射诱导表达人精子蛋白Sp17的细胞模型。方法:用双酶切、粘端连接的方法构建含有辐射诱导特性的早期反应因子Egr-1和人Sp17基因的pEgr-Sp17重组质粒,利用脂质体介导其转染人HO8910细胞,用免疫细胞化学方法检测X线照射后被转染细胞中Sp17的表达。在确证Sp17能瞬时表达后,继续用含G418的RPMI1640培养基培养细胞,筛选稳定表达Sp17的细胞株。结果:测序结果和酶切鉴定均证实pEgr-Sp17重组质粒构建正确;免疫细胞化学试验表明pEgr-Sp17重组质粒转染的人HO8910细胞表达Sp17蛋白。结论:X线可诱导pEgr-Sp17重组质粒在人HO8910细胞中表达Sp17蛋白,构建了Sp17蛋白放射诱导表达的卵巢癌细胞模型。     

癌细胞运动与迁移的分子机制

癌细胞运动和迁移的分子机制远较我们想象的复杂,癌细胞的运动和迁移性和接触性刺激相应答的细胞膜突起形成所启动的多步骤过程的结果.人们普遍想相信,片状伪足在驱动癌细胞迁移中起着主要作用,它通过附着在基底膜上而产生拉动细胞体向前的力量.近来的研究证明,切丝蛋白是癌细胞运动和迁移的一个重要调节因子, 切丝蛋白的局部激活可以诱导片状伪足的形成,并设定细胞运动方向.此外,成束蛋白.Arp2/3复合物、Cdc42、LIM激酶和黏着斑激酶常常协同调节癌细胞的运动和迁移.虽然调节癌细胞运动和迁移的信号通路和分子机制尚未完全阐明,但现有的资料清楚地表明,抑制癌细胞的迁移性将可能成为抑制恶性肿瘤生长和扩散的一个有用的策略.     

用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达新技术

近年来,用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达领域涌现出一系列革命性的新技术。优化的工程细胞为表达重组蛋白提供了优良的宿主;基于荧光的筛选方法可以快捷地得到高表达细胞株;高通量的培养工艺能够预测适合外源蛋白表达的细胞培养条件;可抛弃式生物反应器为大规模细胞培养提供了更多的选择;大规模瞬时表达技术节省了重组蛋白的生产时间。这些新技术提高了重组蛋白的研发和生产效率,加快了蛋白药物的工业化进程。     

Signaling Scaffold Protein IQGAP1 Interacts with Microtubule Plus-end Tracking Protein SKAP and Links Dynamic Microtubule Plus-end to Steer Cell Migration

Cell migration is orchestrated by dynamic interaction of microtubules with the plasma membrane cortex. However, the regulatory mechanisms underlying the cortical actin cytoskeleton and microtubule dynamics are less characterized. Our earlier study showed that small GTPase-activating proteins, IQGAPs, regulate polarized secretion in epithelial cells (1). Here, we show that IQGAP1 links dynamic microtubules to steer cell migration via interacting with the plus-end tracking protein, SKAP. Biochemical characterizations revealed that IQGAP1 and SKAP form a cognate complex and that their binding interfaces map to the WWIQ motif and the C-terminal of SKAP, respectively. The WWIQ peptide disrupts the biochemical interaction between IQGAP1 and SKAP in vitro, and perturbation of the IQGAP1-SKAP interaction in vivo using a membrane-permeable TAT-WWIQ peptide results in inhibition of directional cell migration elicited by EGF. Mechanistically, the N-terminal of SKAP binds to EB1, and its C terminus binds to IQGAP1 in migrating cells. Thus, we reason that a novel IQGAP1 complex orchestrates directional cell migration via coupling dynamic microtubule plus-ends to the cell cortex.     

CD133 蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其与临床病理参数及预后的关系

目的:研究CD133蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与临床病理参数及预后的关系。方法:选择2011年4月~2012年4月间我院收治的42例NSCLC的临床资料,采用免疫组织化学染色法检测癌组织和其中30例癌旁边正常组织CD133的表达,并分析其与肺癌临床病理参数及预后的关系。结果:癌症组织CD133蛋白阳性表达率为57.1%,高于癌旁边正常组织的16.7%,差异有统计学意义(P均0.05);CD133蛋白阳性表达与NSCLC患者年龄、性别以及肿瘤大小、肿瘤位置、组织学类型、组织分化程度以及不同临床分期无关(均P0.05),与淋巴结转移有关,差异有统计学意义(P0.05);CDD133阳性及阴性患者近3年生存率比较,1年生存率比较差异不显著(P0.05),2、3年生存率比较,差异显著有统计学意义(P0.05)。结论:CD133蛋白在NSCLC组织中的高表达,且与NSCLC转移及预后密切相关,对于患者临床特征及预后的关系具有重要的研究价值。     

准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698在真核细胞中的表达与鉴定

目的:构建真核表达质粒pEGFP-N1-mpafp698,转染人胚肾293T细胞,并表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698.方法:PCR扩增出mpafp698序列,将其克隆入本室保存的真核表达载体pEGFP-N1中,转染293T细胞;利用RT-PCR、流式细胞仪、免疫荧光、Western 印迹检测蛋白表达.结果:构...     

IscU2对非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭能力的影响及其作用机制的研究

该文通过shRNA干扰技术敲低IscU2干扰细胞IscU2的表达,研究了干扰IscU2对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞NCI-H520增殖、迁移及侵袭能力的影响。构建了稳定低表达IscU2的非小细胞肺癌细胞系NCI-H520;采用CCK-8和平板克隆实验检测细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期、凋亡、ROS、线粒体膜电位变化情况;Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力;Western blot检测相关蛋白的表达。结果表明,干扰IscU2后,非小细胞肺癌细胞的增殖及克隆形成能力降低;细胞周期停滞在G1/G0期,同时伴随有p-AKT和Cyclin D1蛋白含量的下降;细胞晚期凋亡率明显增加,凋亡蛋白Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP表达上调;细胞迁移和侵袭能力降低,上皮标志物E-Cadherin表达上调,间质标志物N-Cadherin和Snail表达下调;细胞ROS积累和线粒体膜电位下降。该研究结果表明,干扰IscU2显著抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移、侵袭能力和上皮–间质转化,这为非小细胞肺癌的诊断和治疗提供了新的潜在靶点和视角。     

Glycosylphosphatidylinositol Anchor Modification Machinery Deficiency Is Responsible for the Formation of Pro-Prion Protein (PrP) in BxPC-3 Protein and Increases Cancer Cell Motility

The normal cellular prion protein (PrP) is a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored cell surface glycoprotein. However, in pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines, such as BxPC-3, PrP exists as a pro-PrP retaining its glycosylphosphatidylinositol (GPI) peptide signaling sequence. Here, we report the identification of another pancreatic ductal adenocarcinoma cell line, AsPC-1, which expresses a mature GPI-anchored PrP. Comparison of the 24 genes involved in the GPI anchor modification pathway between AsPC-1 and BxPC-3 revealed 15 of the 24 genes, including PGAP1 and PIG-F, were down-regulated in the latter cells. We also identified six missense mutations in DPM2, PIG-C, PIG-N, and PIG-P alongside eight silent mutations. When BxPC-3 cells were fused with Chinese hamster ovary (CHO) cells, which lack endogenous PrP, pro-PrP was successfully converted into mature GPI-anchored PrP. Expression of the individual gene, such as PGAP1, PIG-F, or PIG-C, into BxPC-3 cells does not result in phosphoinositide-specific phospholipase C sensitivity of PrP. However, when PIG-F but not PIG-P is expressed in PGAP1-expressing BxPC-3 cells, PrP on the surface of the cells becomes phosphoinositide-specific phospholipase C-sensitive. Thus, low expression of PIG-F and PGAP1 is the major factor contributing to the accumulation of pro-PrP. More importantly, BxPC-3 cells expressing GPI-anchored PrP migrate much slower than BxPC-3 cells bearing pro-PrP. In addition, GPI-anchored PrP-bearing AsPC-1 cells also migrate slower than pro-PrP bearing BxPC-3 cells, although both cells express filamin A. “Knocking out” PRNP in BxPC-3 cell drastically reduces its migration. Collectively, these results show that multiple gene irregularity in BxPC-3 cells is responsible for the formation of pro-PrP, and binding of pro-PrP to filamin A contributes to enhanced tumor cell motility.