百合斑驳病毒浙江分离物的基因组3′端序列分析

经RT-PCR扩增从浙江丽水的亚洲百合［Lilium cvs.(Asiatic Hybrids)］获得2个Potyvirus病毒分离物G和X的3′端cDNA片段,序列分析表明均为百合斑驳病毒（Lily mottle virus,LMoV）;将12个来源于不同地区百合与郁金香上的Potyvirus分离物进行序列同源性比较和系统进化树分析,结果表明G、X、ML61、1229、2b、MD、HZ、J这8个分离物的CP核苷酸序列同源性达85.9%～100%,在进化树中聚集成簇,归为LMoV;2b2、TM和TBV1 3个分离物同源性达91.2%～99.3%,在进化树中也单独成簇,归为郁金香碎色病毒（Tulip breaking virus,TBV）;2b3 与其它11个分离物同源性在74.4%～79.8%之间,为伦布兰特郁金香碎色病毒（Rembrandt tulip breaking virus,ReTBV）。Nib基因序列和3′UTR序列分析也表明G、X、ML61、1229、J、HZ这6个分离物之间亲缘关系较近,属于LMoV,而TM与它们的亲缘关系很远,属于TBV。LMoV分离物存在着两个群体,G和X分别处在第1群体和第2群体中,不表现地域相关性及寄主相关性。根据研究结果,将迄今世界各地侵染百合与郁金香的Potyvirus分离物归为LMoV、TBV和ReTBV 3个种。     

黄瓜花叶病毒cDNA载体在烟草细胞中表达外源基因

为了探讨利用黄瓜花叶病毒(CMV)构建表达载体的可行性,分离了山东株(SD) CMV RNA 3的全长cDNA。测定其全序列后,采用定点突变的方法在衣壳蛋白(CP)基因起始密码子处改造出一个NsiⅠ位点,可将外源基因引入NsiⅠ位点和CP基因终止密码子上游附近的XhoⅠ或SalⅠ位点而置换掉CP基因。分别用绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-葡糖醛酸酶(GUS)基因以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因3种报告基因置换CP基因。将Fny株CMV RNA 1、RNA 2和SDCMV嵌合RNA 3的cDNA分别插入pCass载体的35S启动子和终止子之间,将构建的置换型载体直接以质粒的方式转染烟草原生质体,表达了3种报告基因。     

马铃薯Y病毒HC-Pro中心区域在病毒协生作用中的主导地位

利用PCR方法获得了马铃薯病毒中国株系(PVY-C)HC-Pro基因的5个缺失突变体,构建了相应的植物表达载体。通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化了烟草品种K₃₂₆(Nicotina tabacum cv.K₃₂₆)。PCR和Southern blot分析证明了HCPro基因及其缺失突变体已整合到烟草基因组中,Western blot表明它们在转基因烟草中得到了表达。侵染性试验发现HCPro中心区域介导转基因烟草中PVY-C和黄瓜花叶病毒(CMV)、PVYC和马铃薯X病毒(PVX)之间的协生作用,从而明确了PVY-C HC-Pro中心区域为病毒协生作用的功能区域。     

杀鞘翅目苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫剂的研究

从中国土壤中分离出2株杀鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) YM03及SHQ11-10。YM03的血清型为H8a8b,SHQ1110的H血清型未知。二菌株皆产近菱形的薄扁伴孢晶体,分别含68～70kD和65kD的晶体蛋白质。毒力生物测定证明对柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)及马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)有高毒效。发酵性能良好。YM03粉剂田间防治马铃薯甲虫有高效。稀释400倍喷雾,防治效果达94.6%。     

编码1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆和表达

采用PCR法克隆了巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）CpN86菌株编码1,3丙二醇氧化还原酶基因（dhaT基因）;完成了dhaT基因测序、表达载体构建和在大肠杆菌中表达;分离和纯化了dhaT基因表达的重组蛋白。实验结果：（1）PCR法克隆的dhaT基因和肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae菌株dhaT基因的序列同源性为829%;（2）dhaT基因表达蛋白的酶活为108U/mg;（3）dhaT基因表达的蛋白分子量为43kD;（4）Western blot确定了dhaT基因表达的蛋白和 CpN86菌株天然蛋白有相同的抗原反应。     

斜纹夜蛾核多角体病毒egt基因的核苷酸全序列分析及同源性比较

测定了斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus, SlNPV)中山大学分离株(Zhongshan University isolate, ZSU)蜕皮甾体尿苷二磷酸葡糖转移酶(Ecdysteroid UDPglucosyltransferase, EGT)基因的核苷酸全序列。该基因编码框包含1530个核苷酸,有509个氨基酸组成的蛋白质,分子量为58.5kD,TATA框位于ATG上游44处。在终止密码子TAA下游13位,有真核生物基因mRNA转录poly(A)加尾酶信号序列：AATAAA。同源性比较显示,SlNPV egt基因推测的氨基酸序列与其它昆虫杆状核多角体病毒EGT序列同源性很高,与海灰翅夜蛾核多角体病毒(Spodoptera littoralis nuclear polyhedrosis virus, SliNPV)同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84%和91%,而且有一些与EGT结构和功能密切相关的氨基酸是绝对保守的;根据EGT蛋白进行分子进化树分析,把昆虫杆状病毒EGT主要分成两大类。     

葡萄扇叶病毒移动蛋白在寄主体内的动态检测和免疫金标记

利用葡萄扇叶病毒法国分离物F13(Grapenive fanleaf virus, GFLVF13)移动蛋白抗体对杭州分离物(GFLVH)移动蛋白进行Western blot,分析表明移动蛋白在接种GFLVH 3d后的苋色藜(Chenopodium amaranticolor)系统叶中就可检测到,随着时间推移,其积累量逐渐升高,接种16d后达到最高值。接种32d后的病叶已经枯黄,但移动蛋白积累量并没有减少。超薄切片电镜观察发现,在感染GFLVH的昆诺藜(C.quinoa)和苋色藜的叶肉组织薄壁细胞中,病毒粒子呈纵列整齐地排列在小管状结构中,在胞间连丝中也发现有管状结构。免疫金标记显示胶体金能定位在细胞质、细胞壁和胞间连丝上,在管状结构也发现有少量的金粒子。这些结果进一步说明了GFLV是通过管状结构实现细胞间移动的。     

枯草芽孢杆菌寡聚1，6-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究用鸟枪法构建了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HB002的基因组文库,经平板法筛选得到了六株能水解合成底物对硝基苯αD葡萄糖吡喃糖苷的阳性克隆,经鉴定均含克隆了寡聚1,6葡萄糖苷酶基因的重组质粒(命名为pHBM001～pHBM006)。选择pHBM003,对其插入片段测序分析,此片段内有一编码561个氨基酸的开放阅读框,该蛋白质的计算分子量为65985kD。HB002的寡聚1,6葡萄糖苷酶的氨基酸序列与Bacillus sp.和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的寡聚1,6葡萄糖苷酶的氨基酸序列一致性分别为81%、67%,相似性分别为89%、79%。从pHBM003中扩增出寡聚1,6葡萄糖苷酶基因,克隆到pBV220上,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到三个能水解对硝基苯αD葡萄糖吡喃糖苷的阳性克隆HBM0031～HBM0033,将此三个菌株热诱导表达,SDSPAGE电泳可检测到特异表达的蛋白质,其中HBM0031、HBM0032表达的蛋白约66kD,为完整的寡聚1,6葡萄糖苷酶,而HBM0033表达的蛋白质偏小;表达的蛋白质均有寡聚1,6葡萄糖苷酶活性。     

钝齿棒杆菌天冬氨酸激酶基因的克隆和序列分析

运用PCR方法,从野生型钝齿棒杆菌株(Corynebacterium crenatum)AS1542及具有AEC抗性的突变株CD945染色体上分别扩增出天冬氨酸激酶(AK)基因(ask),构建了重组质粒。核苷酸序列分析表明,C.crenatum AS1542AK基因与C.crenatum CD945相比,第1199位的碱基由T变为C,引起酶蛋白β亚基第80位氨基酸从亮氨酸变成脯氨酸。该氨基酸的突变在蛋白结构上位于ACT结构域内,该区受赖氨酸调控。C.crenatum AS1542的AK基因的编码区核苷酸序列与C.glutamicum\,C.flavum及B.lactofermentum相比,同源性分别为97.23%、97.55%和97.62%,酶蛋白氨基酸序列的同源性分别为99.76%、99.52%和99.76%。但在AK基因的启动子上游序列部分与其它棒杆菌相比有较大差异。     

寄生疫霉parA1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据已报道的寄生疫霉(Phytophthora parasitica)parA1基因的序列设计引物,从4株寄生疫霉中国菌株(3株来自烟草,1株来自刺槐)中克隆到此基因并进行了重组表达。序列分析表明4株寄生疫霉parA1基因序列高度保守。对表达载体pET30a(+)双酶切,构建表达Parasiticein蛋白的表达载体pETeli,用CaCl\-2法转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,通过诱导在大肠杆菌中进行非融合表达,表达产物在烟草上引起过敏性反应。性质测定表明,表达产物有一定的耐热性,并对蛋白酶K敏感。     

AFLP and DNA sequence variation in an Andean domesticate, pepino (Solanum muricatum, Solanaceae): implications for evolution and domestication

The pepino (Solanum muricatum) is a vegetatively propagated, domesticated native of the Andes, where it grows with wild relatives. We used AFLPs and a 1-kb sequence of the 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase gene to study variation of 27 accessions of S. muricatum and 35 collections of 10 species of wild relatives (Solanum section Basarthrum). A total of 298 AFLP fragments and 29 DNA sequence haplotypes were detected. Cluster and principal coordinate analyses and other genetic parameters estimated from both types of markers, show that S. muricatum is closely related to the species from one of the series (Caripensia) of section Basarthrum and that >90% of the variation of the cultigen is also represented in that series. Pepino is highly diverse, either because it is not monophyletic or it has been subjected to regular introgression with wild species, or both. Although a continuous distribution of the genetic variation occurred within the cultivated species, three genetic clusters were recognized. Cluster 1 is mostly centered in Ecuador, cluster 2 in Ecuador and Peru, and cluster 3 in Colombia and Ecuador. Cluster 3 also includes all modern cultivars studied. These results and other evidence suggest that northern Ecuador/southern Colombia is the main center of pepino diversity and the center of origin. The high genetic variation of this cultigen indicates that domestication does not always produce a genetic bottleneck.     

贵州省25株狂犬病病毒核蛋白基因序列分析

分析贵州省25株狂犬病病毒的核蛋白基因(N基因)序列,探讨贵州省狂犬病流行特征与狂犬病病毒变异情况。以RT-nested PCR检测来自贵州省2005年至2010年不同地区的病人脑组织、病人唾液以及犬脑组织标本狂犬病病毒RNA,经测序与拼接后得到25条N基因全长序列,采用生物信息学软件对N基因序列进行分析。25株狂犬病病毒核蛋白在核苷酸及氨基酸水平上彼此的同源性分别为89.3%～100%和98.%～100%;与国内其他省已发表基因1型狂犬病病毒核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88%～99.1%和88%～99.7%,与已知的基因1型狂犬病病毒比较,25株病毒核蛋白氨基酸序列发生了若干位点的取代。进化树分析显示,同一地区内与相邻地区,以及同一时间段与相邻时间段内狂犬病病毒N基因进化亲缘关系相近。25株贵州省狂犬病病毒流行毒株均属基因1型,其核蛋白在基因的核苷酸及推导的氨基酸水平上均有变异,且这些变异具有地域和时间分布特性。     

Partial sequence of the alpha-tubulin gene from Histomonas meleagridis isolates from the United States

Histomonas meleagridis , the causative agent of histomoniasis, is a protozoan parasite classified in the Dientamoebidae (order Tritrichomonadida). The α-tubulin gene of 7 H. meleagridis isolates originating from either domestic chickens or turkeys from the United States was amplified by nested PCR and sequenced. A 91.4-99.8% nucleotide identity was shared among the 7 different sequences, and phylogenetic analysis disclosed that the 7 isolates were divided into at least 3 clades. These sequences had a 91-99% nucleotide identity and a 96-100% amino acid identity compared with 3 H. meleagridis α-tubulin sequences obtained from isolates originating from turkeys in Germany. Further α-tubulin gene analysis from species in the Dientamoebidae will be useful in elucidating the evolutionary relationship of these protozoans.     

我国西藏小反刍兽疫病毒China／Tib／Gej／07—30核衣壳蛋白基因和基因组启动子区的分子特征分析

首次对我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的核衣壳蛋白(N)基因和基因组启动子(GP)区进行序列测定和分子生物学特征分析。首先应用逆转录聚合酶链式反应从发病山羊病料中扩增出小反刍兽疫病毒N基因片段,用cDNA3′末端快速扩增方法获得基因组启动子区片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,绘制系统发生树。我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的N基因由1689个核苷酸组成,编码525个氨基酸,与India/Jhansi/03等6个已知N基因全序列的PPRV毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.7～97.6和94.9～98.5。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30N蛋白与磷蛋白作用的结构序列之一为495LFRLQAM501保守序列,N蛋白281-289位氨基酸含有一个T细胞表位,为281YPALGLHEF289保守序列。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的GP区由107个核苷酸组成,与Tur-key2000等5株其他PPRV毒株同源性为91.8～98.2。N基因核苷酸序列和相应的氨基酸序列系统进化分析表明小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30与亚洲国家分离株关系最近。     

我国部分地区H9亚型禽流感病毒血凝素基因序列比较与遗传发生关系分析

为从分子水平掌握我国H9亚型AIV的遗传变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国12个省、市、自治区的发病鸡群中分离到的23株H9亚型禽流感病毒,通过RT-PCR方法和核苷酸序列测定获得了23个毒株的HA基因cDNA核苷酸序列。核苷酸和推导的氨基酸序列同源性比较结果表明,这些毒株HA基因的核苷酸序列同源性为94．1％～100％,氨基酸序列同源性为95．4％～100%;将这23个毒株和来自亚洲及世界其它地区的另外31株的HA基因cDNA序列同源性进行比较发现,分离自香港的HK170499株与日本的2个毒株关系较近;氨基酸序列分析发现,CKGS199、CKTJ196、CKTJ296、CKSH300和CKBJ197五个毒株各发生了一个潜在的糖基化位点的丢失。54株H9亚型AIVHA基因55bp～1152bp的氨基酸序列分析发现,裂解位点尽管有10种基序,但本研究中的23株和近年来从我国大陆和香港地区的分离的毒株则均为RSSR↓GLF;构成受体结合位点的191位氨基酸有一个规律,即所有中国大陆毒株与部分香港毒株都为N,其它毒株均为H,141aa～143aa处的糖基化位点有与191aa类似的规律,即：凡是191aa为N的毒株,该处均为NVS（CKBJ194除外）,凡是191aa为H的毒株,则该处均为NVT;遗传发生关系分析,中国大陆毒株处于欧亚谱系的第一支。本研究结果表明近年来我国鸡群中H9N2亚型禽流感病毒的感染流行可能有一个共同的来源,这为制定防治该亚型禽流感流行的有效对策提供了重要的科学依据。     

马铃薯Y病毒pl基因的克隆与序列分析

利用依据马铃薯Y病毒(PVY)pl基因序列设计合成的一对引物YP1,YP2,以带毒烟草总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到了0.83kb的目的条带,测序结果表明为PVY pl基因。通过对PVY P1蛋白氨基酸序列分析发现PVY不同分离物间P1蛋白氨基酸序列存在明显差异,氨基酸序列同源性在64％～94％间。依据P1蛋白氨基酸序列建立了PVY系统关系树并对PVY进行了类型分析。     

野生茄子（Solanum torvum）抗黄萎病相关基因Sto Vel的克隆与分析

采用RT—PCR和RAcE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVel,其cDNA全长3400bp,含有3153bp的完整开放阅读框,编码1051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Vel编码的氨基酸序列同源性分别为82％、81％和80％,且有很高的功能区段保守性。将该cDNA全长序列提交Gen Bank,登陆号为DQ020574。半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少。     

Characterization and signature pattern analysis of Korean clade HIV-1 using nef gene sequences

Phylogenetic studies of the HIV-1 gene sequences isolated from Korean patients have suggested that most of Korean isolates belong to the subtype B strain. This study aims to characterize the Korean clade by molecular phylogenetic analysis using all of the Korean nef gene sequences registered in the NCBI GenBank (N=422), in addition to 41 reference strains and 94 foreign isolates. Through phylogenetic analyses, we verified that most of the Korean isolates belonged to the subtype B, where 78.8% are clustered exclusively of foreign isolates. This cluster has been named the Korean clade subtype B (KCB) in order to distinguish it from other subtype B clusters. Genetic distance analysis suggested that the KCB cluster was more homogeneous and clearly distinctive from the non-Korean clade subtype B (NKCB). Comparison of consensus amino acid sequences from KCB and NKCB revealed that characteristic KCB signature amino acid patterns composed of 11 amino acid residues, whose frequencies in the KCB were significantly higher than in the NKCB. The KCB signature amino acid residues were critical in identifying KCB from NKCB, since substitution of the NKCB sequences with KCB signature amino acids relocated them to the Koran clade, and vice versa.