解淀粉芽胞杆菌关键酶基因过表达对鸟苷积累的影响

【目的】研究鸟苷生物合成途径中的3个关键酶编码基因(prs,purF,guaB)过表达对解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵生产鸟苷的影响。【方法】利用穿梭表达载体PBE43,构建含有prs、purF和guaB基因的单独表达载体和prs、purF基因的串联表达载体,将它们分别转入鸟苷生产菌B.amyloliquefaciens TA208后,通过实时定量PCR测定各工程菌株内相关基因的转录水平;通过酶活检测分析关键酶基因扩增对肌苷酸脱氢酶活性的影响;通过摇瓶发酵实验考察工程菌株与对照菌株的生长、耗糖和鸟苷积累情况。【结果】转录分析结果表明prs、purF和guaB基因过表达的同时都伴随着自身转录水平的显著上调。与此同时,prs和purF基因单独表达均轻微下调了嘌呤操纵子的转录水平,但是guaB基因的过表达并不影响嘌呤操纵子和prs基因的转录。酶活分析结果表明prs和purF基因扩增并不影响肌苷酸脱氢酶的活性,guaB基因的扩增使其活性提高了126%。摇瓶发酵实验发现prs和purF基因的单独过表达均未促进宿主菌合成鸟苷,而含guaB基因过表达载体的工程菌鸟苷产量较出发菌株提高20.7%。将prs和purF基因串联表达后,鸟苷产量提高14.4%,糖苷转化率增加6.8%。【结论】过表达guaB基因能够大幅提高鸟苷产量,而prs和purF基因只有实现协同表达才能对宿主菌积累鸟苷产生积极影响,为通过代谢工程技术提高鸟苷产量奠定了研究基础。     

关键基因的修饰对枯草芽孢杆菌尿苷合成的影响

【目的】探究磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶(prs)和氨甲酰磷酸合成酶(pyr AA/pyr AB)的点突变,以及异源5′-核苷酸酶(sdt1)的过表达,对枯草芽孢杆菌尿苷生物合成的影响。【方法】依据推断的变构位点,分别在prs基因和pyr AB基因编码序列中引入点突变;将点突变的prs基因在染色体xyl R位点整合表达,pyr AB基因则在染色体原位被修饰;sdt1基因在染色体sac B位点整合过表达。通过对重组菌摇瓶发酵液中尿苷、胞苷和尿嘧啶的分析,表征相关基因修饰对尿苷合成的影响。【结果】在PRPP合成酶中引入Asn120Ser、Leu135Ile和Glu52Gly或Val312Ala点突变,分别导致尿苷积累量提高67%和96%。进一步在氨甲酰磷酸合成酶中引入Ser948Phe、Thr977Ala和Lys993Ile点突变,导致尿苷积累量又增加了182%,达到6.97 g/L。在此基础上,过表达异源5′-核苷酸酶,导致尿苷产量增加17%,达到8.16 g/L。【结论】PRPP合成酶和氨甲酰磷酸合成酶的酶活或反馈抑制调节机制,是限制尿苷过量合成的重要因素。PRPP合成酶的Asn120Ser和Leu135Ile点突变,以及氨甲酰磷酸合成酶的Ser948Phe、Thr977Ala和Lys993Ile点突变,能够显著促进尿苷合成。PRPP合成酶附加的Glu52Gly或Val312Ala点突变,有利于尿苷合成。异源的嘧啶专一性5′-核苷酸酶的引入,也对尿苷的合成有明显的促进作用。     

枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的修饰对腺苷积累的影响

【目的】研究嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因的共同过表达对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响。【方法】利用温敏质粒pKS1,以单交换的形式增加了purF基因在基因组上的拷贝数,同时将强启动子P43插入嘌呤操纵子中,使嘌呤合成途径中purF基因及其下游purM、purN、purH和purD基因的表达水平得到加强,通过实时定量PCR(Realtime Quantitative PCR,RT-qPCR)测定相关基因(purF、purM、purN、purH和purD)的转录水平;通过酶活性检测分析关键酶基因扩增对PRPP转酰胺酶活性的影响;通过发酵实验考察出发菌株与工程菌株的生长、耗糖和腺苷积累情况。【结果】实时定量PCR结果表明,purF、purM、purN、purH和purD基因的表达水平均有不同程度的提高,嘌呤合成途径中关键酶PRPP转酰胺酶的活性是出发菌株的2.4倍。摇瓶发酵实验发现工程菌腺苷产量较出发菌提高17.5%,糖苷转化率增加26.1%。5 L罐发酵实验表明,虽然工程菌的菌体生长受到一定的影响,但在相同发酵周期内腺苷产量比出发菌提高了9.7%。【结论】嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因转录水平的增强能够提高腺苷的产量,为通过代谢工程技术改造腺苷生产菌提供了理论依据和研究思路。     

聚乙二醇胁迫对甘蔗伸长期间叶中脯氨酸积累及其代谢关键酶活性的影响

甘蔗品种‘桂糖119’(‘GT119’)、‘新台糖16号’(‘ROC16’)、‘新台糖22号’(‘ROC22’)为材料,在甘蔗伸长期用25%聚乙二醇(PEG)6000淋灌于根部。第4天,‘GT119’与‘ROC16’叶中游离脯氨酸含量明显上升,但‘ROC22’在处理后6d内其含量增加仍不明显。吡咯啉-5-羧酸合成酶活性变化因品种而异,‘ROC22’在处理后第6天才明显上升,其他2个品种则在胁迫处理1d后即明显提高。鸟氨酸转氨酶活性变化不明显。‘ROC22’在处理1d后其脯氨酸脱氢酶活性稍有提高,而其他2个品种则下降。     

溶血卵磷脂对人内皮细胞CD73的调节与PKC的关系

目的：探讨溶血卵磷脂（LPC）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）胞外5’-核苷酸酶（CD73）的调节作用及其与蛋白激酶C（PKC）的关系。方法：将含已融合HUVEC的细胞培养皿分为4组（n=15）：①LPC组：培养皿中加入LPC10μmol/L;②CHE（白屈菜赤碱,PKC抑制剂）组：加入CHE100μmol/L及LPC10μmol/L;③AOPCP（α,β-甲基腺苷-5′-二磷酸,CD73抑制剂）组：加入AOPCP50μmol/L及LPC10μmol/L;④对照组：无干预。每组均于实验开始时加入乙烯-单磷酸腺苷（eAMP,5μmol/L）。在实验第15、30、45min测定各培养皿中乙烯-腺苷（eAD）含量。结果：在上述三个时间点LPC组HUVEC的eAD生成均较对照组显著增高（P〈0.05）,加入CHE使LPC的这种增加作用消失,其eAD生成与对照组无差别（P〉0.05）,而AOPCP组eAD生成较其它三组均显著减少（P〈0.01）。结论：LPC可兴奋内皮细胞胞外CD73,此作用可被PKC抑制剂CHE抑制,LPC上调CD73活性作用可能与PKC有关。     

橄榄果实发育成熟过程中糖积累与相关酶活性的关系

以可溶性总糖含量差异明显的2个橄榄品种为试验材料,测定果实发育成熟过程中蔗糖、葡萄糖、果糖、可溶性总糖含量及蔗糖代谢相关酶活性的动态变化,并对果实糖积累与酶活性进行相关性分析,以明确不同橄榄品种果实糖积累差异的生理基础,为进一步在代谢与分子水平探讨橄榄果实糖积累机制提供依据。结果表明:(1)蔗糖快速积累期是橄榄品种间果实蔗糖积累差异的关键时期,并影响成熟时果实可溶性总糖含量的高低,其中‘马坑22’蔗糖快速积累期较长,增长幅度较大,成熟时可溶性糖含量高;成熟时‘马坑22’、‘檀头23’果实内己糖与蔗糖比分别为0.668、0.904。(2)在蔗糖快速积累期内,‘马坑22’酸性转化酶(AI)活性低于‘檀头23’,为其蔗糖积累创造条件,而中性转化酶活性高于后者则有利于其增加果实库强;两品种蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性变化差异不大,说明SPS不是蔗糖积累的关键酶;‘马坑22’蔗糖合成酶(SuSy)合成方向活性在花后144~186d增幅显著高于‘檀头23’,说明SuSy为果实蔗糖积累的关键酶。(3)‘马坑22’蔗糖快速积累主要依靠SuSy合成方向活性变化促进蔗糖合成,‘檀头23’蔗糖快速积累主要依靠SuSy分解方向活性变化促进蔗糖直接进入果实。     

刺梨果实中维生素C积累与相关酶活性的关系

刺梨果实发育过程中维生素C(AsA)积累呈"慢一快一慢"的模式,其中6月底至8月初是AsA积累最快和最重要的时期.半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)活性与AsA积累速率的变化趋势基本一致,二者间呈极显著的正相关关系.AsA分解酶抗坏血酸氧化酶(AAO)和抗坏血酸过氧化物酶(AAP)只在发育前期极短时间内表现活性,从而使AsA极少被氧化分解,这是刺梨果实能积累高水平AsA的重要原因之一;在果实发育过程中始终未能检测到单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)的活性,表明它们不是刺梨果实积累高含量AsA的关键因素.     

葛根淀粉合成关键酶活性动态及其与块根产量和淀粉积累的相关性研究

为探讨葛根发育过程中淀粉合成关键酶活性与块根产量和淀粉积累的关系,以初步揭示其内在的生理机制。该研究以‘桂葛1号’粉葛和‘桂葛8号’野葛为材料,采取生理测定法对农艺性状、直链和支链淀粉的含量、淀粉合成关键酶活性等进行测定,并对葛根发育过程中淀粉合成关键酶活性、农艺性状和淀粉含量动态变化的关系进行相关性分析。结果表明：(1)块根发育过程中,两品种葛根腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、束缚性结合淀粉合成酶(GBSS)和淀粉分支酶(SBE)的活性呈现先增大后降低的单峰曲线变化,与直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量由缓慢增长到快速增长后趋于稳定的变化趋势基本一致,即在块根形成期至膨大期逐渐增长,至膨大后期达到最大,之后迅速下降,至成熟期缓慢下降,并维持在较高水平。(2)‘桂葛8号’的淀粉含量和产量显著高于‘桂葛1号’,其酶活性也均显著高于‘桂葛1号’。(3)葛块根的根长、根粗、单株重、干物质含量、产量表现为“缓慢-快速-稳定”的变化趋势,淀粉含量表现出类似变化。(4)相关性分析结果显示,4个淀粉合成关键酶活性与块根直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量、根长均呈显著或...     

大麦种子萌发过程核酸分解酶的研究

大麦种子萌发后,幼苗中存在着丰富的磷酸酯酶,主要五种磷酸酯酶在幼根中活性最高,其次是胚乳(RNase,DNase,PDase)或幼芽(PMase,5′-NDase)未萌发种子五种酶活性均低。五种磷酸酯酶在种子萌发过程中的消长表现了明显的规律性,幼芽五种酶的活性峰出现在种子萌发后第二天,胚乳在5～6天,幼根的RNase,DNase,PMase消长规律类似胚乳,PDase和5′-NDase类似幼芽。说明大麦磷酸酯酶的活性和种子萌发过程有一定的相关性。大麦幼苗五种磷酸酯酶都有很高的最适反应温度,一般在50～70℃之间,反应温度低于20℃活性急剧下降,低于10℃活性趋于零。五种磷酸酯酶的最适pH都偏酸性,一般在pH 5～6,但PDase和DNase除在酸性区有一最适pH外,在碱性区也各有一最适pH,推测大麦幼苗RNase,PMase,5′-NDase均只有一种酸性的酶,而PDase和DNase各有一种酸性酶和碱性酶。     

积累L-苹果酸的米根霉突变株酶活性初探

对富马酸产生菌株—米根霉ME-F10进行诱变育种的过程中, 得到一株性能稳定的高效积累L-苹果酸的突变株ME-M15。该菌株发酵96 h平均L-苹果酸产量达16.3 g/L, 较出发菌株L-苹果酸积累量平均提高3倍, 而富马酸和乙醇的积累量大幅下降。对突变株代谢途径关键酶活研究表明, 突变株富马酸酶胞质途径同功酶和乙醇脱氢酶活力较之出发菌株酶活力明显减弱, 而丙酮酸羧化酶活力无明显差别。     

枇杷果实发育过程中糖积累及相关酶活性变化研究

以'青种'、'霸红'和'鸡蛋白'3个枇杷品种为材料,测定不同果实发育时期果实中蔗糖、葡萄糖和果糖含量以及蔗糖代谢相关酶即酸性转化酶(AI)、中性转化酶(NI)、蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性,并对果实中糖积累与酶活性的关系进行了分析.结果表明:在果实膨大期(5月3日)之前,3种枇杷果实的蔗糖、葡萄糖和果糖积累缓慢,之后则迅速积累,存在着明显的转折点;果实成熟(5月23日)之后糖分积累速度趋于平稳.3种枇杷果实在发育过程中转化酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性变化与3种糖积累的动态变化趋势相一致.NI和AI活性在果实膨大期之前都较低且没有明显的变化,之后均快速上升;SS和SPS的活性在果实膨大期之前都很低且几乎无变化,随后'鸡蛋白'的活性迅速上升至果实成熟之后便缓慢上升,而'青种'和'霸红'随果实成熟度的增加而升高,但均低于'鸡蛋白'.可见,枇杷果实膨大期是糖分积累代谢活跃期,其糖积累受蔗糖代谢相关酶综合调控.     

不结球白菜维生素C积累与相关酶活性研究

对不结球白菜‘常州乌塌菜’、‘矮脚黄’和‘二青’生长过程中维生素C(AsA)含量和L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)、抗坏血酸氧化酶(AAO)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)的活性进行测定分析,结果显示,AsA含量的积累呈先升高后下降的模式,且‘常州乌塌菜’中的AsA含量显著高于‘矮脚黄’和‘二青’;GalLDH活性与AsA含量变化趋势基本一致,且3个品种中GalL-DH活性与AsA积累之间均呈极显著的正相关关系;AAO和APX活性的变化趋势则与AsA含量变化趋势相反,而‘常州乌塌菜’中AAO活性显著低于其它2个品种,但APX活性无显著差异;MDAR和DHAR的活性则主要表现在生长后期。结果表明,不结球白菜中AsA含量主要受GalLDH酶活性调节,同时AsA代谢酶AAO也对AsA积累起到了重要作用,而MDAR和DHAR酶活性对AsA积累的作用主要在生长后期。     

Redox and Chemical Activities of the Hemes in the Sulfur Oxidation Pathway Enzyme SoxAX

SoxAX enzymes couple disulfide bond formation to the reduction of cytochrome c in the first step of the phylogenetically widespread Sox microbial sulfur oxidation pathway. Rhodovulum sulfidophilum SoxAX contains three hemes. An electrochemical cell compatible with magnetic circular dichroism at near infrared wavelengths has been developed to resolve redox and chemical properties of the SoxAX hemes. In combination with potentiometric titrations monitored by electronic absorbance and EPR, this method defines midpoint potentials (E_m) at pH 7.0 of approximately +210, −340, and −400 mV for the His/Met, His/Cys⁻, and active site His/CysS⁻-ligated heme, respectively. Exposing SoxAX to S₂O₄²⁻, a substrate analog with E_m ∼−450 mV, but not Eu(II) complexed with diethylene triamine pentaacetic acid (E_m ∼−1140 mV), allows cyanide to displace the cysteine persulfide (CysS⁻) ligand to the active site heme. This provides the first evidence for the dissociation of CysS⁻ that has been proposed as a key event in SoxAX catalysis.     

赤霉素诱导甘蔗节间伸长的效应与相关酶活性的关系

以甘蔗品种'新台糖22号'为试验材料,在伸长初期以200 mg/L GA3进行叶面喷施处理,对照喷清水,研究GA3处理后甘蔗节间糖苷酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的变化,以揭示赤霉素诱导甘蔗节间伸长与相关酶活性的关系.结果表明:(1)GA3处理的株高在各个时期显著高于对照,而且在处理后7、14和28 d分别比对照提高了17.32%、14.50%和8.35%,GA3处理引起甘蔗植株表现的高度优势一直保持到后期,节间伸长效果主要是在茎的中部(5～10节).(2)GA3处理后α-葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶的活性较对照显著下降;POD和β-半乳糖苷酶的活性也略有下降;α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基已糖苷酶、过氧化氢酶的活性显著提高;β-葡萄糖苷酶的活性也有一定程度提高.由此推测,外源GA3主要通过调节α-葡萄糖苷酶活性、α-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基已糖苷酶活性和过氧化氢酶,其次是POD、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性,最终达到节间伸长效果.     

Wnt信号通路与皮肤创面愈合的关系

创面愈合是由炎性细胞、细胞因子等多种因素共同参与,涉及组织修复、再生、重建的一个复杂有序的病理生理过程。皮肤慢性创面的愈合仍然是临床研究的重点与热点,随着分子生物学的发展,对皮肤创面愈合机制的认识也逐渐深入。Wnt信号通路是一条由Wnt蛋白及其受体、调节蛋白等组成的高度保守的信号通路,参与细胞增殖、凋亡、分化等多种生物学过程。Wnt信号通路作为参与皮肤愈合的信号通路之一,被认为具有调控皮肤及其附属器的发育、诱导皮肤附件的形态发生、调节毛囊的周期生长、促进创面血管新生及上皮重塑等多方面的功能。因此本文试从炎性细胞、成纤维细胞、干细胞、血管新生、表皮新生与毛囊新生等方面对Wnt信号通路与皮肤创面愈合的关系作一综述。     

脑肠肽Ghrelin-GHSR信号系统与肿瘤的关系

脑肠肽Ghrelin是一种含有28个氨基酸的生长激素释放肽,为生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue recep-tor,GHSR)的内源性配体。Ghrelin及其功能性受体GHSR-1a广泛分布于中枢和外周组织。此外,在多种肿瘤组织和癌细胞中发现有Ghrelin及其功能性受体GHSR-1a的表达。我们的前期工作和目前的研究发现Ghrelin可与经典的功能性受体GHSR-1a或新型受体结合,通过激活多条信号转导通路,对肿瘤的生物学行为发挥重要的调控作用。因此,脑肠肽Ghrelin-GHSR信号系统可为肿瘤的临床诊断和预后评估发挥重要作用,并为肿瘤的分子治疗提供新靶点。     

植物中草酸积累与光呼吸乙醇酸代谢的关系

对几种C3 和C4 植物中草酸含量及相应的乙醇酸氧化酶活性测定结果表明 :叶片光呼吸强度及其关键酶活性大小与草酸积累量没有相关性 ;植物根中均能积累草酸 ,但未测出乙醇酸氧化酶活性。烟草根、叶中的草酸含量在不同生长时期差异明显 ,且二者呈极显著正相关 (y =2 .5 6 5lnx 2 .137,r =0 .749,P <0 .0 0 1) ,说明根中草酸可能来自叶片。氧化乙醇酸的酶的活性与氧化乙醛酸的酶的活性呈极显著线性正相关 (y =0 .2 41x 0 .0 0 6 ,r=0 .96 7,P <0 .0 0 0 1) ,进一步证实是乙醇酸氧化酶催化了两种底物的反应。烟草在不同生长期叶片中草酸总含量变化与相应的乙醇酸氧化酶活性变化亦没有相关性 ;低磷胁迫可显著诱导烟草根叶中的草酸形成和分泌 ,但并未影响乙醇酸氧化酶活性 ,进一步证明草酸积累与该酶活性大小无关     

干旱胁迫对紫花苜蓿黄酮类化合物含量及其合成途径关键酶活性的影响

以3个紫花苜蓿(Medicago sativa)品种为试验材料,利用不同浓度(0、5%、10%、15％、20%、25%)的PEG 6000溶液模拟干旱胁迫,探究干旱胁迫对不同品种紫花苜蓿黄酮类化合物合成上游3个关键酶活性以及黄酮类化合物含量的影响。结果表明：(1)随着PEG 6000胁迫浓度的增加,3种紫花苜蓿叶片中PAL(苯丙氨酸解氨酶)、C4H(肉桂酸 4 羟基化酶)和4CL(4 香豆酸辅酶A连接酶)活性均呈先升高后降低的趋势,但不同酶类之间响应存在差异,即PAL活性在10% PEG 6000胁迫浓度下最高,C4H和4CL活性则在15% PEG 6000胁迫浓度下最高,且均显著高于相应对照。(2)3种紫花苜蓿植株地上部总黄酮含量和8种黄酮类化合物含量均随着PEG 6000胁迫浓度的增加呈先上升后下降的趋势,且均在10%~15% PEG 6000胁迫浓度时达到最高值,并显著高于相应对照。(3)各品种紫花苜蓿叶片黄酮类化合物含量与其关键酶活性呈不同程度的相关性,即紫花苜蓿黄酮类化合物合成途径上游3个关键酶活性与其地上部黄酮类化合物含量存在密切的关系。研究认为,不同程度的干旱胁迫可以通过促进黄酮类化合物合成途径上游关键酶活性的变化来调节紫花苜蓿植株中黄酮类化合物的合成,且适度干旱胁迫能显著促进相关酶活性增强和黄酮类化合物含量增加。     

Organic Acids Accumulation and Antioxidant Enzyme Activities in Thlaspi caerulescens under Zn and Cd Stress

Growth, organic acid and phytochelatin accumulation, as well as the activity of several antioxidative enzymes, i.e. superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX) guaiacol peroxidase (POX) and catalase (CAT) were investigated under Zn and Cd stress in hydroponically growing plants of Thlaspi caerulescens population from Plombières, Belgium. Tissue Zn and Cd concentration increased (the highest concentration of both was in roots) as the concentration of these metals increased in the nutrient solution. Increasing Zn concentration enhanced plant growth, while with Cd it declined compared to the control. Both metals stimulated malate accumulation in shoots, Zn also caused citrate to increase. Zn did not induce phytochelatin (PC) accumulation. In plants exposed to Cd, PC concentration increased with increasing Cd concentration, but decreased with time of exposure. Under Zn stress SOD activity increased, but APX activity was higher at 500 and 1000 μM Zn and CAT activity only at 500 μM Zn in comparison with the control. CAT activity decreased in Cd- and Zn-stressed plants. The results suggest that relative to other populations, a T. caerulescens population from Plombières, when grown in hydroponics, was characterized by low Zn and Cd uptake and their translocation to shoots and tolerance to both metals. The accumulation of malate and citrate, but not PC accumulation was responsible for Zn tolerance. Cd tolerance seems to be due to neither PC production nor accumulation of organic acids.