双波长法测定二元混合体系中戊糖的含量

目的:针对单波长法在测定己糖和戊糖的混合体系中戊糖含量时出现较大的误差,提出了等吸收双波长法测定二元混合体系中戊糖的含量.方法:通过对己糖(葡萄糖)和戊糖(木糖)的不同含量(5-150μg/体系)与显色剂反应产物在不同波长(500,～700nm)条件下吸光曲线以及显色剂本身吸光曲线进行综合考虑,确定双波长,并对单双波长法测定同样样品的回收率进行了比较分析.结果:确定的测定波长为670nm,参比波长为580nm,双波长法建立的标准曲线方程为:Y=0.0056x-0.0123(y为两个波长下吸光度的差值,x为木糖的含量(μg)).R2=0.9995,线性范围为5-30μg/体系.单波长法对标样和试样的平均回收率分别为116%±15%和89%±13%;双波长法对标样和试样的平均回收率为104%±4%和95%±11%.结论:与单波长和一些其他方法相比,双波长法测定混合体系中戊糖含量较为简便易行且可以提高准确度.     

基于钙黄绿素- 铜(Ⅱ)荧光体系测定乙酰半胱氨酸

目的:基于钙黄绿素-铜(Ⅱ)荧光体系测定乙酰半胱氨酸。方法:在pH=8.0的Na2HPO.412H2O-KH2PO4缓冲液中,以492 nm为激发波长,520 nm为发射波长测定乙酰半胱氨酸溶液的荧光强度。结果:在pH=8.0的Na2HPO.412H2O-KH2PO4缓冲液中,二价铜离子与钙黄绿素配位引起荧光猝灭。由于乙酰半胱氨酸中巯基上的硫离子与Cu2+的亲和力很强,可从钙黄绿素-铜(Ⅱ)的络合物中夺取铜离子而使钙黄绿素游离出来,从而使体系的荧光得以恢复,并且荧光恢复的程度与加入乙酰半胱氨酸的量在一定范围内成线性。结论:建立了一种测定乙酰半胱氨酸的荧光分析新方法,该方法的线性范围为6.0 10-6～1.4 10-5 mol/L,检出限为4.010-6 mol/L。     

嗜热丁烷氧化古菌Candidatus Syntrophoarchaeum烷基转移酶MtaA催化丁基辅酶M的分子机制研究

【背景】嗜热古菌Candidatus Syntrophoarchaeum可以与硫酸盐还原细菌共生,通过逆转产甲烷途径进行正丁烷的氧化,但在该过程中负责催化丁基辅酶M氧化的酶尚未确定。【目的】利用分子动力学模拟证明Ca.Syntrophoarchaeum中mta A基因编码的蛋白可以特异性催化丁基辅酶M中丁基的转移,并非转移甲基。【方法】使用Methanosarcina mazei辅酶M甲基转移酶Mta A的晶体结构(PDB ID:4ay8)作为模板,对Mta A_1 (Gen Bank登录号OFV65993.1)和Mta A_2 (Gen Bank登录号OFV65678.1)进行同源建模。使用分子对接得到两者分别结合CH_3-Co M和C_4H_9-Co M时的结构,并用AMBER18进行分子动力学模拟。【结果】当Mta A_1和Mta A_2分别结合C_4H_9-Co M时,表现出与4ay8晶体结构类似的TIM-Barrel折叠三维结构,但在活性中心形状、Zn~(2+)与底物距离以及活性位点附近氨基酸配位方式等方面存在差异,这可能是导致Ca.Syntrophoarchaeum中mta A基因编码的蛋白催化丁基辅酶M氧化的原因。其中Mta A_2与4ay8结构更相似,活性中心氨基酸配位更完整,暗示其更可能具备催化活性。然而当Mta A_1和Mta A_2分别结合CH_3-Co M时,整体结构不合实际,活性中心Zn~(2+)与底物距离过远,表明底物几乎不可能与酶结合。【结论】Ca.Syntrophoarchaeum中的Mta A_1和Mta A_2很可能是特异性的丁基转移酶,而非催化甲基的转移,其中Mta A_2具备活性的可能性更高。     

蛋白质二硫键异构酶的纯化和活力测定

 从500g新鲜牛肝制得蛋白质二硫键异构酶(PDI,EC 5.3.4.1)98mg。该酶制剂在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为亚基分子量62,000的均一条带。在260nm追踪,因二硫键错接而失活的牛胰核糖核酸酶A,经PDI作用使其二硫键重排恢复活力,从而催化酵母RNA的水解来测定PDI活力。这种单波长法比文献中介绍的追踪A_(260)—A_(280)的双波长法更为灵敏方便。酶的克分子消光系数ε_M=1.03×10~5(pH7.5),其比活性为1400单位/克蛋白质。     

碱催化合成4-甲基-2'-羟基-4'-甲氧基查尔酮及其晶体结构

探讨超声波辅助下用碱催化合成查尔酮的方法。常温超声波辅助下用碱催化使丹皮酚和4-甲基苯甲醛发生克莱森-斯密特反应,生成一种含有1,3-二苯基丙烯酮结构的丹皮酚衍生物:4-甲基-2'-羟基-4'-甲氧基查尔酮,产率高达71.57%,经过现代光谱学技术紫外、红外、质谱并结合核磁的氢谱、碳谱以及135°DEPT谱表征其结构。用X射线衍射技术分析该丹皮酚衍生物的单晶结构并确定其分子的构型和构象,4-甲基-2'-羟基-4'-甲氧基查尔酮属于单斜晶系中的P2(1)/n空点群,晶胞参数:a=1.1288(10)nm、b=0.6916(6)nm、c=2.0509(4)nm、α=90.0(8)°、β=109.8(8)°、γ=90(8)°,晶胞体积V为1.4056(5)nm3,密度Dc为1.272 mg/cm3。在超声波辅助下用碱催化可使丹皮酚和4-甲基苯甲醛通过克莱森-斯密特反应来合成含有1,3-二苯基丙烯酮结构的丹皮酚衍生物。     

基于钙黄绿素-铜（Ⅱ）荧光体系测定乙酰半胱氨酸

目的：基于钙黄绿素-铜（Ⅱ）荧光体系测定乙酰半胱氨酸。方法：在pH=8.0的Na2HPO.412H2O-KH2PO4缓冲液中,以492 nm为激发波长,520 nm为发射波长测定乙酰半胱氨酸溶液的荧光强度。结果：在pH=8.0的Na2HPO.412H2O-KH2PO4缓冲液中,二价铜离子与钙黄绿素配位引起荧光猝灭。由于乙酰半胱氨酸中巯基上的硫离子与Cu2＋的亲和力很强,可从钙黄绿素-铜（Ⅱ）的络合物中夺取铜离子而使钙黄绿素游离出来,从而使体系的荧光得以恢复,并且荧光恢复的程度与加入乙酰半胱氨酸的量在一定范围内成线性。结论：建立了一种测定乙酰半胱氨酸的荧光分析新方法,该方法的线性范围为6.0 10-6～1.4 10-5 mol/L,检出限为4.010-6 mol/L。     

光系统Ⅱ反应中心D_1-D_2-Cyt b_(559)复合物低温(77K)荧光发射差异的研究

对菠菜光系统Ⅱ反应中心D_1-D_2-Cytb_(559)复合物进行了系统的低温(77K)荧光发射性质研究。结果表明,D_1-D_2-Cytb_(559)复合物具有681nm和684nm两种波长的低温荧光发射,但两者通常并不是同时存在,而是取决于Ca-680与Ca-670Chla分子的相对含量的。Ca-670Chla含量的增加,会使其低温荧光发射出现在681nm;而Ca-680Chla含量的增加,则会使其低温荧光发射出现在684nm。Ca-670与Ca-680Chla分子的相对含量与不同状态的菠菜叶材料有关。PSⅡ反应中心内周天线CP-47,CP-43多肽的存在是D_1-D_2-Cytb_(591)复合物低温荧光发射红移的原因,而D_1-D_2-Cytb_(559)复合物的不稳定变化则与其蓝移的低温荧光发射有关。     

可见分光光度法测定人尿中痕量1-萘酚

目的:建立一种可见分光光度法单独测尿中痕量1-萘酚的新方法。方法:在碱性介质中,1-萘酚（1-NAP）与氯霉素作用生成蓝色物质导致体系的吸光度增加,2-NAP不干扰测定。结果:该蓝色产物的最大吸收波长λmax=472.0nm,其吸光度与1-NAP摩尔浓度在7.64×10^-7mol/L～6.31×10^-4mol/L范围内线性关系良好,线性回归方程为△A=0.3146C+0.0239,相关系数r=0.9973,检出限为2.29×10^-7mol/L,相对标准偏差RSD为3.25%～6.42%,加标回收率为95.3%～105.7%。结论:本方法灵敏、简单、快速、易于推广,用于人尿中1-NAP含量的单独测定结果满意。     

荷叶中紫云英苷和牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究

本文采用荧光光谱法、紫外光谱法研究在生理条件(pH=7.4)下荷叶中紫云英苷(AST)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。结果表明AST可与BSA结合并通过静态猝灭作用机制对BSA内源性荧光进行猝灭。在温度为298K及308K时,测得其猝灭速率常数(Kq)分别为4.31×1013L/mol/s和3.72×1013L/mol/s;结合常数(Kd)分别为2.009×105L/mol和0.927×105L/mol;结合位点数(n)分别为0.943和0.893。依据298K时测定的反应自由能变(△G0=-30.25kJ/mol),反应焓变(△H0=-59.02kJ/mol)及反应熵变(△S0=-96.54J/mol/K),结果发现AST与BSA间的结合反应可自发进行且其作用力主要表现为氢键和范德华力。此外,根据Frster非辐射能量转移理论得到AST与BSA之间的结合距离(r)为4.13nm,表明非辐射能量可从BSA转移至AST。     

(S)-羰基还原酶Ⅱ与葡萄糖脱氢酶共催化高效合成(S)-苯乙二醇北大核心CSCD

【目的】通过优化获得最佳酶活配比,设计近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶Ⅱ与枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)YX-1葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的共表达体系,实现重组菌高效催化2-羟基苯乙酮,合成(S)-苯乙二醇。【方法】分别从重组大肠杆菌中纯化了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶,研究了2种酶共催化2-羟基苯乙酮的最佳酶活比例,最适催化温度和pH,由此构建(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶的共表达体系。【结果】(S)-羰基还原酶Ⅱ的比酶活力为1.3 U/mg,葡萄糖脱氢酶的比酶活力为13.5 U/mg。在总酶活力为1 U时,(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶共催化体系中,确定了2种酶的最佳比例在1∶1到5∶1(U/U)之间,最适反应温度为30℃,pH为7.0。在此基础上构建了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶基因比为1∶1的共表达体系,共表达重组菌破碎上清液中(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶酶活分别为0.76 U/mg和0.73 U/mg,两者的酶活比例为1∶1。在上述确定的最适催化条件下,其催化10 g/L 2-羟基苯乙酮,产物(S)-苯乙二醇的光学纯度和得率均高达99%以上。与仅含有(S)-羰基还原酶Ⅱ的重组大肠杆菌相比,共表达体系转化产物(S)-苯乙二醇的得率明显提高,且转化时间由原来的24 h缩短为13 h。【结论】通过确定(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶最佳酶活配比,为构建手性催化的靶酶和辅酶再生酶共表达体系,为实现手性化合物的高效制备提供了研究基础。     

α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其催化羟基化反应的影响

【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。     

可见分光光度法测定人尿中痕量1-萘酚

目的：建立一种可见分光光度法单独测尿中痕量1-萘酚的新方法。方法：在碱性介质中,1-蔡酚（1-NAP）与氯霉素作用生成蓝色物质导致体系的吸光度增加,2-NAP不干扰测定。结果：该蓝色产物的最大吸收波长Amax=472．0nm,其吸光度与1-NAP摩尔浓度在7．64×10^-7mol／L-6．31×10^-4mol／L范围内线性关系良好,线性回归方程为△A=0．3146C＋0．0239,相关系数r=0．9973,检出限为2．29×10^-7mol／L,相对标准偏差RSD为3．25％-6．42％,加标回收率为95．3％-105．7％。结论：本方法灵敏、简单、快速、易于推广,用于人尿中1-NAP含量的单独测定结果满意。     

变色酸显色法同时测定核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性

提出一个用变色酸-硫酸显色浊同时测定核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)羧化酶/加氧酶活性的方法:RuBP羧化酶/加氧酶与底物作用后,用碱性磷酸酯酶将其产物水解生成乙醇酸和甘油酸,然后与变色酸试剂在1:5的体积比下,沸水浴中显色反应90min,乙醇酸与变色酸反应生成红紫色化合物,甘油酸生成淡棕色化合物,分别在573nm,745nm各有一特征吸收峰。根据A_(573),A_(745)与乙醇酸和甘油酸浓度间的函数关系式,求出RuBP羧化酶/加氧酶活性。     

金耳环精油镇痛成分的研究

从金耳环(Asarum gracilipes C S Yang,)全草中提取精油,并经柱层析分为A_1,A_2,A_3.A_4四部分。与辽细辛(A.heteropoides)精油对照。经药理实验证明。金耳环和辽细辛都有较好的中枢抑制作用,金耳环精油的A_2.A_3部分镇痛作用较好。经GC/MS/DC联用仪分析检索,在金耳环精油中鉴定出28个已知化学成分,A_2部分主要成分为:2,3-二甲基-5-甲氧基苯酚,黄樟醚和细辛醚。A_3部分主要成分为龙脑,甲基丁香酚,橙花叔醇,2,3,4.5-四甲氧基苯丙烯,茴香酸丙酯,邻苯二甲酸二丁酯。     

MS/MS技术在确定清香桂碱A和A_1混晶结构中的应用

清香桂(Sarcococca ruscifolia)植物中得到一个清香桂碱A和A_1的共晶,我们通过化学及光谱方法确定了清香桂碱A_1及B的化学结构,并用MS/MS技术证实了这个混晶的结构。这几个生物碱的结构为,碱A(1)为Δ~(14,16)-3α-二甲胺孕甾二烯;碱A_1(2)为Δ~(16)-3α-甲基甲酰胺孕甾烯;碱B(5)为Δ~(16)-3α-二甲胺孕甾烯-20-酮。     

Sortase A介导的(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体高效立体选择性转化(S)-苯基乙二醇

【目的】以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的sortase A为"分子订书机",用于(S)-羰基还原酶Ⅱ分子之间的连接,获得催化功能与稳定性增强的氧化还原酶寡聚体,高效催化2-羟基苯乙酮,合成(S)-苯基乙二醇。【方法】从S.aureus基因组中克隆sortase A基因,在大肠杆菌中表达,通过镍柱和凝胶层析纯化重组酶,获得纯酶sortase A。通过基因工程手段在(S)-羰基还原酶Ⅱ的C末端添加GGGGSLPETGG序列,蛋白纯化获得(S)-羰基还原酶Ⅱ-GGGGSLPETGG,摸索了sortase A催化(S)-羰基还原酶Ⅱ-GGGGSLPETGG的分子连接,形成(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体的最佳条件,并研究了寡聚体酶学性质及生物转化(S)-苯基乙二醇的效率。【结果】(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体比酶活力为38.5 U/mg,比原始型(S)-羰基还原酶Ⅱ提高了6倍,最适反应温度为50°C,最适pH为6.0,在50°C放置1 h后酶活仍旧保持90%以上;蛋白质变性实验结果显示,(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体的变性温度为60.1°C,比原始酶提高了10°C;生物转化结果显示(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体在3 h内完全转化5 g/L 2-羟基苯乙酮,产生光学纯度为100%的(S)-苯基乙二醇,相比于重组大肠杆菌(S)-羰基还原酶Ⅱ全细胞催化时间缩短了16倍。【结论】本研究首次将sortase A应用于氧化还原酶的分子连接,显著提高了酶的催化效率和热稳定性,表明sortase在手性催化中有很大的潜在应用价值。     

A_(21)—Asp人胰岛素突变体2.4埃分辨率晶体结构研究

A_(21)-Asp人胰岛素(A_(21)D-HI)是经由蛋白质工程途径制备的突变体,具有高稳定特性.本文报道在2.4埃分辨率A_(21)-HI X-射线晶体结构的测定,所获结构模型经能量制约的最小二乘技术(EREF)精化,最后的晶体学一致性因子R=0.192,共价键长与标准值的平均偏差为0.019埃.在(2F-F_e)电子密度图上,突变残基A_(21)-Asp清晰可见.与天然胰岛素比较,除践基A_(21)外,突变体分子的构象在该分辨率未见显著变化,具有重要结构意义的残基A_(21)-NH与B_(23)-Co之间的主链氢键在两个独立分子中都仍然保持,A链末端羧基与B_(22)-Arg的侧链胍基间的盐键在分子中也仍然保持.在这一基础上,讨论了突变体与分子的化学稳定性和生物活力的关系.     

基于钙黄绿素的荧光分光光度法测定谷胱甘肽

目的:基于钙黄绿素的荧光分光光度法建立一种测定谷胱甘肽的新方法。方法:在pH=8.0介质中,铜(Ⅱ)与钙黄绿素配位引起荧光猝灭,由于谷胱甘肽与铜(Ⅱ)的亲和力很强,可从钙黄绿素-铜离子的络合物中夺取铜离子而使钙黄绿素游离出来使荧光强度得以恢复,荧光恢复的程度与加入谷胱甘肽的浓度在一定浓度范围内成线性。结果:据此建立了一种测定谷胱甘肽的新方法,该方法的线性范围为2.0×10-6～1.4×10-5mol.L-1,F=8.1964C+196.43,检测限为1.0×10-6mol/L。结论:用此法测定谷胱甘肽简便快速,灵敏度高。     

基于高光谱的苹果花磷素含量监测模型

在室内条件下,利用ASD FieldSpec 3地物光谱仪,测定了盛花期苹果花的高光谱反射率,在分析苹果花原始光谱反射率及其一阶导数特征的基础上,分析了高光谱反射率与磷素含量间的相关关系,确定其敏感波段,构建了特征光谱参数,并建立了苹果花磷素含量的监测模型.结果表明：苹果花磷素含量与350～370 nm、670～1385 nm、1620～1760 nm波段的原始光谱反射率以及波段500～520 nm光谱反射率的一阶导数呈极显著正相关,与波段670～730 nm一阶导数呈极显著负相关;光谱参数DVI(936,676)、DVI(977,676)、NDVI(936,676)、NDVI(977,676)与苹果花磷素含量的相关性较好,其相关系数均达到0.77以上,由此建立了以4种光谱参数为自变量的磷素含量监测模型,其中,以NDVI(936,676)为自变量构建的监测模型具有最大的决定系数（R²=0.9385）、最小的均方根误差（RMSE=0.6883）和最小的相对误差（RE=7.6%）,预测精度达到92.4%,为最佳监测模型.     

酶法合成中丙氨酸的检测

本文建立了丙氨酸在醋酸缓冲液中形成丙氨酸-铜配离子及其十二烷基磺酸配离子对,使其紫外无吸收的丙氨酸在230nm处于有强紫外吸收,从而对酶法合成中的丙氨酸进行定量分析．该法在0～50mg／L范围内有良好的线性关系,直线方程为A(230)=0.01712·C（n=5）C：mg／L）。相关系数为0．9994,回收率为96．8％～104．0％,且该法不受酶反应液的影响,实验结果证明该检测体系简单、实用、测定结果可靠。