猪流感病毒抗原表位基因表达载体构建与免疫原性分析

根据猪流感病毒血凝素蛋白基因(Heamuglutinine, HA)的核苷酸序列, 设计、筛选HA蛋白氨基酸序列的主要表位多肽4个, 将4个片段以柔性连接串联成模拟蛋白, 核苷酸约为300 bp, 体外扩增该模拟蛋白基因, 插入到原核表达载体pET30a(+)中, 转染宿主菌诱导表达, 结果获得分子量为20 kD的表达蛋白, 该蛋白可与抗His-tag抗体、抗猪流感病毒H1N1、H3N2亚型高免血清发生免疫学反应。纯化后免疫小鼠, ELISA及血凝抑制(Heamuglutinine inhibitor, HI)试验检测, 小鼠产生针对多肽抗原的血清抗体, 同时还可检测到H1N1、H3N2亚型SIV血凝抗体。流氏细胞仪检测免疫组外周血淋巴细胞高于对照组, 说明该模拟蛋白具有与H1N1、H3N2亚型猪流感病毒相似的免疫原性及反应原性, 为H1N1、H3N2血清亚型猪流感病毒疫苗研制提供了新手段。     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒Ｓ基因４种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达。结果表明表达的４种ＧＳＴ－ＮＰ融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于茵体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的２９－３６％,分子量分别约为７２ｋＤ、６６ｋＤ、５４ｋＤ和４４ｋＤＤ。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示５４ｋＤ和７２ｋＤ融合蛋白用酶标记汉滩病毒ＮＰＭｃＡｂｌＡ８和抗ＧＳＴ ＭｃＡｂ ３Ｃ１１染色呈阳反应。６６ｋＤ和４４ｋＤ融合蛋     

确定病毒B细胞抗原表位的策略

抗原表位是诱生免疫反应的抗原最基本单位,根据其功能的不同,可大致分为Ｂ细胞、Ｔｈ细胞及Ｔｃ细胞抗原表位。如何确立这些抗原表位是近年分子免疫学研究的热点。本文综述了有关确立病毒Ｂ细胞抗原表位的方法及策略,并评价了这些方法的优缺点及适用范围。     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒S基因4种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达.结果表明表达的4种GST-NP融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于菌体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的29-36%,分子量分别约为72 kD、66 kD、54 kD和44 kD.Western blot显示54 kD和72 kD融合蛋白用酶标抗汉滩病毒NP McAb 1A8和抗GST McAb 3C11染色呈阳性反应.66 kD和44 kD融合蛋白仅与酶标3C11呈阳性反应.用凝血酶切去GST,获得4种汉滩病毒重组核蛋白(rNP),分子量分别约为44 kD、40 kD、26 kD和16 kD.用19株McAb对表达产物做抗原位点分析,结果完整的rNP可与19株McAb中的13株反应,McAb反应谱与天然NP相同;S1.1 kb表达产物(N-端1-37和C端402-429位aa缺失)和S 0.5 kb表达产物(N-端1-274位aa缺失)与19株McAb均不发生反应;S0.7 kb表达产物(C-端275-429位aa缺失)可与5株组特异性McAb反应.表明汉坦病毒核蛋白上的抗原位点主要存在于N-端1-37位aa区段内.     

HCV抗原表位预测

应用网络生物信息资源查找丙型肝炎病毒基因组全序列,用软件Lasergene中的EditSeq将来自中国河北株mRNA序列翻译为氨基酸序列,尔后用程序Protean进行氨基酸序列分析,对HCV各区段的B细胞抗原指数进行预测。同时又在两个网站对中国汉族人中频率较高的HLA基因型进行CD8和CD4T细胞表位预测。B细胞和T细胞抗原表位预测结果对于HCV诊断试剂和疫苗研制有重要的指导意义。     

用免疫荧光单克隆抗体对脊髓灰质炎病毒抗原表位的分析

用间接免疫荧光与中和试验筛选出来的抗脊髓灰质炎2型与3型不同毒株的12个单克隆抗体,其中3个仅有免疫荧光活性,9个具有中和与免疫荧光活性。用免疫荧光活性的单克隆抗体进行试验,发现它们在识别特异性抗原表位方面与中和性单克隆抗体相似,显示出株特异的、几个毒株共同特异的或型特异的抗原表位。根据表位分布关系及特征,可以用来鉴别型内毒株的特征、毒株的抗原分析、抗原变异的研究以及疫苗相关病例的鉴别。所得结果与中和性单克抗隆抗体及T1-寡核苷酸指纹图谱分析一致。而免疫荧光单克隆抗体识别抗原表位的活性范围比中和性单克隆抗体更广。另外还发现某些兼有荧光与中和两活性的同一个单克隆抗体,用不同方法(IF与NT)进行试验时,与相同毒株出现不同表位反应,这点是值得引起注意需待进一步证实的重要问题。     

蛋白质抗原表位研究进展

本文综述了蛋白质抗原表位的种类及特性,回顾了近几年来实验确定和理论预测B细胞蛋白质抗原表位的常用方法,介绍了表位作图和表位疫苗的研究现状。     

HCV复合多表位抗原基因表达及免疫原性的研究

分类号Ｑ７８１文献标识码Ａ文章编号０００１６２０９（１９９９）０３０２６８７１丙型肝炎是常见的传染病之一,易于慢性化及发展为肝硬化,且与肝癌的发生关系密切,目前尚无理想的防治手段。国内外对丙型肝炎疫苗的研究仍处于克隆表达ＨＣＶ部分基因产物或合成…     

禽流感病毒M2e、NP多表位嵌合肽抗原的构建及免疫原性

摘要: 【目的】为了克服传统禽流感疫苗各亚型之间无交叉保护的缺陷,研制抗禽流感通用型疫苗。【方法】 以禽流感病毒M2e、NP表位为基础串联T细胞表位构建4个原核表达载体: pET-3M2e、pET-3M2e-NP1,2-Fc、pET-3M2e-NP1,2、pET-TCE-3M2e-NP1,2。纯化重组蛋白并与弗氏佐剂混合制成疫苗,胸部肌肉注射免疫20日龄非免鸡(150μg/只),4个融合蛋白分为四组,每组十只。ELISA方法检测血清中M2e抗体水平;在MDCK细胞上检测血清与H9N2亚型禽流感病毒的结合能力,在鸡胚上检测其中和能力;以流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞的变化。【结果】研究发现,各免疫组均能检测到高水平的ELISA抗体,免疫荧光显示抗血清均能跟病毒特异性结合,中和试验表明抗血清不能中和病毒但能抑制病毒的复制。流式细胞仪检测显示外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞所占比例在免疫后均有明显升高(P<0.05),TCE-3M2e-NP1, 2组CD4+、CD8+T淋巴细胞所占比例分别达到47.23%和36.77%,具有细胞免疫的特征。【结论】构建的嵌合肽抗原具有较好的免疫原性,能刺激机体产生体液和细胞免疫,为进一步研制抗禽流感通用型疫苗做出有益的探索。     

多表位病毒疫苗的研究进展

多表位病毒疫苗是目前病毒疫苗研制的特点,特别是对目前病毒疫苗研制的热点,特别是对于易变异或者本身有癌基因的病毒。本文就近年来这方面的研究进展作一综述。     

H1N1亚型猪流感病毒的拯救

利用8质粒拯救系统成功拯救出了猪流感病毒毒株A/Swine/TianJin/01/2004(H1N1)(A/S/TJ/04)。将猪流感病毒8个基因节段经RT-PCR合成cDNA后, 分别克隆到RNA聚合酶I/II双向表达载体PHW2000中, 构建成8个重组质粒。用8个重组质粒共转染COS-1细胞, 30 h后加入TPCK-胰酶至终浓度0.5 mg/mL。共转染48小时后收获COS-1细胞及其上清, 经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚。收获死亡鸡胚尿囊液并继续用SPF鸡胚传3代, 得到有感染性的病毒。经血凝、血凝抑制验、测序分析、电镜观察等均证实了A/S/TJ/04猪流感病毒的成功拯救。这是目前国内首次报道拯救出H1N1亚型猪流感病毒, 为进一步研究猪流感病毒基因组结构与功能的关系、流感跨种传播的机制以及构建新型猪流感疫苗株奠定了基础。     

猪流感病毒分离鉴定

用非免疫鸡胚从我国上海、福建、湖北分离到3株猪流感病毒,分别命名为SSH1、SFJ1和SHB1。SIV分离株第5代病毒液对0．7％豚鼠红细胞的血凝活性分别1：2^8、1：2^7和1：2^8,与H3亚型标准血清血凝抑制价1：2^8、1：2^7和1：2^8,但不能被鸡新城疫阳性血清所抑制。纯化的病毒在电镜下观察,可见到猪流感典型的病毒粒子。病毒液接种于小白鼠,可表现出临床症状,剖杀后可观察到病毒性肺炎。猪体回归试验,可表现出临床症状和病理变化,从肺脏中可分离到病毒并且RT-PCR也可检测到病毒相应的基因片段。从纯化的病毒中提取RNA,进行RT-PCR,可扩增出预期的条带。     

H1N1亚型猪流感病毒的拯救

利用8质粒拯救系统成功拯救出了猪流感病毒毒株A/Swine/TianJin/01/2004(H1N1)(A/S/TJ/04)。将猪流感病毒8个基因节段经RT-PCR合成cDNA后, 分别克隆到RNA聚合酶I/II双向表达载体PHW2000中, 构建成8个重组质粒。用8个重组质粒共转染COS-1细胞, 30 h后加入TPCK-胰酶至终浓度0.5 mg/mL。共转染48小时后收获COS-1细胞及其上清, 经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚。收获死亡鸡胚尿囊液并继续用SPF鸡胚传3代, 得到有感染性的病毒。经血凝、血凝抑制验、测序分析、电镜观察等均证实了A/S/TJ/04猪流感病毒的成功拯救。这是目前国内首次报道拯救出H1N1亚型猪流感病毒, 为进一步研究猪流感病毒基因组结构与功能的关系、流感跨种传播的机制以及构建新型猪流感疫苗株奠定了基础。     

Localization Analysis of Heterophilic Antigen Epitopes of H1N1 Influenza Virus Hemagglutinin

Previous studies have indicated that two monoclonal antibodies(mAbs; A1-10 and H1-84) of the hemagglutinin(HA)antigen on the H1 N1 influenza virus cross-react with human brain tissue. It has been proposed that there are heterophilic epitopes between the HA protein and human brain tissue(Guo et al. in Immunobiology 220:941–946, 2015). However,characterisation of the two mAbs recognising the heterophilic epitope on HA has not yet been performed. In the present study, the common antigens of influenza virus HA were confirmed using indirect enzyme-linked immunosorbent assays and analysed with DNAMAN software. The epitopes were localized to nine peptides in the influenza virus HA sequence and the distribution of the peptides in the three-dimensional structure of HA was determined using PyMOL software. Key amino acids and variable sequences of the antibodies were identified using abYsis software. The results demonstrated that there were a number of common antigens among the five influenza viruses studied that were recognised by the mAbs. One of the peptides, P2(LVLWGIHHP191–199), bound both of the mAbs and was located in the head region of HA. The key amino acids of this epitope and the variable regions in the heavy and light chain sequences of the mAbs that recognised the epitope are described. A heterophilic epitope on H1 N1 influenza virus HA was also introduced. The existence of this epitope provides a novel perspective for the occurrence of nervous system diseases that could be caused by influenza virus infection, which might aid in influenza prevention and control.     

猪戊型肝炎核酸疫苗的构建及在BAL B/C小鼠免疫效应

将含有kozak序列及BamH I的上游引物和带有终止密码子及EcoRV酶切位点的下游引物,以猪HEVDQ1 ORF2为模板,进行PCR。将扩增片段和pcDNA3.1质粒以BamH I/EcoRV进行双酶切后进行连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α,经测序证明该序列正确,命名为pcDQ1。进行pcDQ1质粒提取,以Vero细胞为表达细胞进行转染,以间接免疫荧光试验进行验证。以100μg/次/只剂量的pcDQ1对BAL B/C小鼠进行免疫以获取单因子血清。共免疫3次,采集血清,进行ELISA效价测定。结果表明,该核酸疫苗可以免疫使小鼠产生抗体。     

禽流感病毒与人流感的关系

禽流感病毒 (AIV)是甲 (A)型流感病毒 ,常引起禽类全身性感染或主要限于呼吸器官传染病 ,带来巨大的经济损失并严重威胁人类健康。对AIV的基因组、所编码的蛋白质及其功能、AIV毒力变异的分子基础、禽流感疫苗以及AIV与人流感的关系等进行概述。     

表达流行性感冒病毒血凝素蛋白的重组腺病毒的构建

用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增流感病毒血凝素基因,将其克隆到５型腺病毒载体质粒ｐＡＤ５Ｃ中。用此质粒与ＥｃｏＲＩ酶切回收的５型腺病毒基因组片段共转染２９３细胞,通过ＰＣＲ初步筛选得到重组病毒。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ重组病毒能表达流感病毒的血凝素蛋白。此重组病毒经滴鼻免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ实验证明能诱导小鼠产生针对流感的循环抗体ＩｇＧ和分泌型抗体ＩｇＡ。本实验证明,利用Ｅ     

猴痘病毒CrmB蛋白的结构特征及其抗原表位分析

为深入了解猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)的CrmB(cytokine response modifier B)蛋白的结构特征和抗原表位，运用ORF Finder、ExPaSy、SignalP 6.0、TMHMM 2.0、Cell-Ploc、Conserved Domains、 SOPMA、SWISS-MODEL、NetNGlyc 1.0、NetPhos 3.1、IEDB、SYFPEITHI、Clustalx、MEGA 11.0、Prankweb、DrugBank等多种生物信息学方法，分析CrmB蛋白的开放阅读框、理化性质、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、结构域、糖基化/磷酸化位点、二级/三级结构、B/T细胞抗原表位、抗原决定簇、蛋白同源性、配体结合位点、小分子抑制药物等。CrmB蛋白是由349个氨基酸组成的不稳定蛋白质，相对分子量为38 308.75;理论等电点为6.24,分子式为C₁₆₂₁H₂₅₅₀N₄₆₀O₅₅₀S₃₂;二级结构以不规则卷曲为主，有信号肽...     

H1N1型流感病毒神经氨酸酶的原核表达、纯化及免疫原性分析

目的：研究H1N1型流感病毒神经氨酸酶（NA）在原核系统中的表达、纯化方法及其免疫原性。方法：构建了大肠杆菌表达载体pET22b-NA,并转化了大肠杆菌BL21（DE3）;通过SP-Sepharose Fast Flow柱对重组NA进行分离纯化,并用Sephadex G-25柱对SP柱后获得的NA进行柱上复性;用不同剂量的重组NA免疫BALB/c小鼠,并检测其诱导产生的抗体滴度。结果：大肠杆菌表达的NA以包涵体形式存在,通过分离及柱上复性,纯化得到重组NA;NA抗原的免疫原性是剂量依赖的,随着剂量的增加,其免疫原性相应增强,3次免疫后,3μg NA诱导小鼠产生的抗体滴度最高,为1∶7000。结论：大肠杆菌表达的NA具有一定的诱导小鼠产生针对天然NA的抗体的能力,为流感病毒基因工程疫苗研究提供了初步线索。