用醋酸铵制备质粒DNA的简便方法

我们在生物化学与分子生物学实验教学中开设了质粒 DNA制备及酶切鉴定实验。鉴于本科生实验单元时间短 (4学时 ) ,用常规的 Brinboim和 Doly方法进行质粒 DNA的制备往往不能在规定学时内完成实验。因此 ,我们对原有的实验方法 ,略加改进 ,采用高离子浓度中性盐一步沉淀质粒 DNA,制备出高纯度、高产率的质粒 DNA样品。1　材料与方法1.1　材料　 p UC19重组质粒为本室构建 (内插入一约为 1kb大小的片段 ) ;LB培养基 ;溶液 (含 5 0 mmol葡萄糖 ,10 mmol EDTA,2 5 mmol Tris- HCl,p H8.0 ) ;溶液 (含新鲜配制 0 .2 N Na OH及 1%…     

一种简易的制备和纯化质粒DNA的方法

近年来随着遗传工程的飞速发展,DNA重组技术被广泛应用,许多实验室在制备一定纯度、产量较高、方法简便的质粒DNA方面作了许多工作。国外大多数实验室普遍采用CsCl等密度梯度超离心法,但国内受仪器限制,应用较少。我们比较了PEG沉淀质粒DNA, 羟基磷灰石法制备质粒DNA,快速抽提质粒DNA,以及M.A.K柱制备质粒DNA等方法,它们都各有利弊。本实验室对L.P.Elwell的实验条件稍作改进,温和地制备清亮裂解液并抽提质粒DNA,然后应用Sephacryl S-1000作凝胶过滤,获得了纯度高、产量大,无染色体DNA     

以Triton X-114液相分离法去除质粒溶液中的内毒素

目的：采用TritonX-114液相分离法去除质粒溶液中的内毒素,以保证实验动物的安全和结果的准确性。方法：通过碱裂解法提取质粒pVAX1和pVAX1-hLDHC,用聚乙二醇6000沉淀对质粒进一步纯化;用TritonX-114抽提的方法,去除质粒溶液中的内毒素。结果：通过3轮TritonX-114抽提,能够将质粒溶液中内毒素水平降至1．95EU／mL,质粒样品的回收率为79．8％,质量保持不变。结论：TritonX-114液相分离法是一种非常有效的去除质粒溶液中内毒素的方法。     

大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化

目的:简化操作流程,缩短提取时间,降低试验对操作者的危害。方法:该方法去除酚、氯仿等有害试剂,采用LiCl沉淀去除质粒制备物中小片段核酸(包括DNA和RNA);工程菌生长至对数期时通过加入氯霉素后不仅方便质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除,而且可使质粒的拷贝数进一步增加,提高质粒DNA产量的目的。结果:实验改进方法所提取的质粒DNA产量高于常规方法,达到20μg/mL。结论:改进方法提取的质粒DNA,其下游的内切酶消化,PCR、重组质粒鉴定、转化大肠杆菌等实验的结果和重复性都令人满意,完全可用于一般的分子生物学研究。     

一种简单实用的适于大、小质粒的DNA提取方法

以Birabolm和Doly的质粒提取方法为基础,用醋酸铵取代醋酸钠,沉淀染色体DNA和RNA,用异丙醇取代乙醇沉淀质粒DNA,降低了质粒DNA标本中蛋白质和RNA的含量,减少了标本体积。并发现在质粒DNA标本中加入冷异丙醇或冷乙醇后,在-70℃、-20℃、-10℃、4℃和室温下作用,对质粒DNA的回收量无明显影响,在质粒DNA标本中加入冷异丙醇后,在4℃作用0、10、20和30分钟,对质粒DNA的回收量无明显影响。用该方法提取的质粒DNA可直接用于限制性内切酶消化。用该方法提取大肠埃希氏菌     

一种简易的分离根癌土壤杆菌质粒的方法（简报）

土壤杆菌属的一些菌含有分子量达100兆道尔顿的大质粒。根癌土壤杆菌的Ti质粒是潜在的植物遗传工程载体。目前制备这类大质粒主要用Currier＆Nester[1]和van Larebeke ＆ Schell[2]的方法。一般认为土壤杆菌破壁困难,需用溶菌酶、蛋白酶。虽然Currier＆Nester[1]把DNA变性后以酚和氯仿-异戊醇清除了一些染色质,但残存染色质仍多。两法最后都靠密度梯度离心法获得纯质粒。这样,就限制了制备Ti质粒的规模。我们采用Hensen＆Olsen[3]4 ％SDS和热冲击方法破壁,在控制温菌量和破壁液比例的条件下,不用酶也能破壁。然后,用酚和氯仿-异戊醇抽提去蛋白;不经 DNA变性,用Zasloff等人的酸酚法去染色质DNA; 再用Humphreys等人的方法,以PGA6000沉淀浓缩质粒DNA.经琼脂糖电泳鉴定,得单一DNA带,无染色质扩散带。这就为大规模制备根癌土壤杆菌Ti质粒提供了可能。目前正在进一步工作。     

一种经济、简便和准确鉴定重组质粒的方法

目的：提高重组质粒的筛选效率,探讨一种经济、快速并准确的重组质粒鉴定方法。方法：取200μl菌液于Eppendorf管中高速离心1min,倒出上清,沉淀中加入20μl裂解缓冲液以裂解细胞并释放出内部质粒,10000r/min离心10min后取5～10μl上清液进行琼脂糖凝胶电泳,并比较其迁移位置来以判断重组质粒。结果：该方法鉴定结果和PCR鉴定结果完全一致。结论：该方法具有成本低廉、简便快速的特点,在对大量样品进行鉴定时具明显优势,适合在常规实验室推广。     

基因枪介导真核表达质粒转染体外培养的COS-7细胞系的实验研究

目的：建立基因枪子弹制备及转染体外培养COS-7细胞系的方法。方法：以亚精氨、氯化钙沉淀法制备子弹（DNA＋金颗粒）,利用原子力显微镜观察子弹制备情况;采用基因枪方法分别将真核表达质粒pVax-Dsred-IRES-EGFP转染对照组和实验组COS-7细胞,转染后24h,利用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞中红、绿荧光蛋白的表达。结果：制备了基因枪子弹,DNA紧密包裹在金颗粒周围;基因枪介导的pVax-Dsred-IRES-EGFP被转染入体外培养的COS-7细胞,转染后24h可检测到红、绿荧光,而对照组则没有荧光蛋白的表达。结论：国产新芝SJ-500型基因枪能够有效介导外源基因转移,基因枪转染的COS-7细胞能够有效表达报告基因。     

临床等级质粒DNA的实验室制备

在实验室有效获得100 mg临床试验等级的质粒DNA.摇床发酵3个批次,每批次4 L培养液,产生大约160 g的细菌沉淀物.碱裂解菌体,气浮法结合离心分离浮杂沉淀.裂解液经0.45/0.22 μm囊式过滤器过滤.然后采用阴离子色谱介质富集质粒,异丙醇沉淀.重新溶解沉淀后采用100 kD切向流超滤处理,获得100 mg临床试验等级质粒DNA.体外、体内转染试验对质粒表达效果进行了鉴定.结果表明,纯化的质粒DNA几乎检测不到内毒素、RNA和蛋白质,A260/A280比值在1.82～1.86范围内.纯化的质粒DNA能够满足动物临床试验.     

重组甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白的纯化及其多克隆抗体制备

目的：制备可用于甘蔗花叶病毒（ScMV）E株系（ScMV-E）检测用多克隆抗体。方法：将ScMV-E外壳蛋白（CP）基因连接到pET29a（＋）上,经PCR检测、酶切及测序鉴定获得重组质粒pET29a-CP,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达重组ScMV-E外壳蛋白;采用His Trap Kit纯化目的蛋白,作为抗原免疫新西兰大白兔,制备特异性抗体;通过间接ELISA、Western blot和组织印迹法检测所制备抗体的特异性。结果：SDS-PAGE分析表明,重组融合蛋白含6个组氨酸标记,相对分子质量约43000;Western blot检测显示所获得的抗体特异性良好,间接ELISA法测得血清的效价为1：81 920;甘蔗叶片的组织印迹检测结果显示杂交效果良好。结论：制备的多克隆抗体可直接用于ScMV-E检测,并有望用于制备ScMV-E检测试剂盒。